이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.
혈관 질환의 전 임상 약물 연구는 높은 처리량 스크리닝으로 수정 할 수있는 혈관 구조의 체외 모델이 필요합니다. 그러나, 충분한 처리량을 가진 시험관내 검열 모형은 생체외에서 생체외에 사실 인정의 번역을 방해하는 한정된 생리학적 관련성이 있습니다. 다른 한편으로는, 미세 유체 세포 배양 플랫폼은 시험관에서 비교할 수없는 생리적 관련성을 보였지만 종종 필요한 처리량, 확장성 및 표준화가 부족합니다. 우리는 관류 및 그라데이션을 포함하여 생리학적 관련 세포 미세 환경에서 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC-EC)에서 파생 된 내피 세포의 혈관 신생을 연구하는 강력한 플랫폼을 보여줍니다. iPSC-EC는 패턴콜라겐-1 스캐폴드에 대해 40개의 교전된 3D 마이크로혈관으로 배양된다. 혈관 신생 요인의 구배를 적용하면 혈관 신생의 중요한 특징을 연구 할 수 있습니다. 형광 추적염료를 가진 관류는 혈관신생 콩나물의 안모증 도중 그리고 후에 투과성의 연구할 수 있습니다. 결론적으로, 이 방법은 iPSC 유래 EC의 실현 가능성을 표준화되고 확장 가능한 3D 혈관조인성 분석법으로 보여주며, 이 에 통합될 수 있는 견고성과 확장성을 겸비한 플랫폼에서 생리학적 관련 배양 조건을 결합한 분석 약물 스크리닝 인프라.
시험관 내 모델은 혈관 질환의 새로운 약물 표적의 발견 및 검증에 근본적인 역할을 합니다. 그러나, 충분한 처리량을 가진 시험관내 검열 모형은 생체외에서 생체외에 사실 인정의 번역을 방해하는 한정된 생리학적 관련성1이있습니다. 따라서, 전임상 혈관 약물 연구를 진행하기 위해서는, 높은 처리량의 스크리닝과 생리학적으로 관련된 3D 세포 마이크로 환경을 결합하는 혈관내 모델의 개선이 필요하다.
지난 10 년 이내에, 혈관 내 체외 모델의 생리적 관련성을 증가시키기 위해 상당한 진전이 이루어졌다. 조직 배양 플라스틱과 같은 평평한 표면에 내피 세포를 배양하는 대신, 내피 세포는 피브린 및 콜라겐겔2와같은 3D 스캐폴드에 내장될 수 있다. 이러한 행렬 내에서, 내피 세포는 매트릭스 분해 및 루멘 형성과 관련된 보다 생리학적으로 관련된 표현형을 보여준다. 그러나, 이들 모델은 세포 미세환경으로부터의 중요한 단서로서 혈관신생 발아 중에 발생하는 많은 과정의 서브세트만을 입증한다.
미세 유체 세포 배양 플랫폼은 혈관 내 체외 모델의 생리적 관련성을 더욱 증가시키기에 유일하게 적합하다. 예를 들어, 내피 세포는 전단 스트레스에 노출될 수 있으며, 이는 혈관 구조에 중요한 생체 역학 적 자극입니다. 또한, 미세 유체 학적 내에서 유체를 공간적으로 제어 할 수있는 가능성은 생체 분자 그라데이션3,4,5,6의형성을 허용합니다. 이러한 그라데이션은 혈관신생 동안 형성 및 패터닝 동안 생체 내에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 미세 유체 세포 배양 플랫폼은 전통적인 2D 및 3D 세포 배양 방법에 비해 비교할 수없는 생리학적 관련성을 보였지만, 종종 약물 스크리닝에 필요한 처리량, 확장성 및 표준화가 부족합니다. 7. 또한, 이러한 플랫폼의 대부분은 상업적으로 사용할 수 없습니다 및 최종 사용자가 사용하기 전에 자신의 장치를 microfabricate 필요8. 이것은 제조 장치 및 기술 지식을 필요로 할뿐만 아니라 품질 관리 수준을 제한하고 재현성에 부정적인 영향을 미칩니다9.
현재까지, 1차 인간 내피 세포는 시험관내 혈관신생을 모델링하기 위해 가장 널리 사용되는 세포 공급원으로 남아있다 10. 그러나, 1 차적인 인간 세포는 검열 접근에 있는 그들의 일상적인 신청을 방해하는 제한의 수있습니다. 첫째, 1 차적인 세포 파생배양을 확장하고 확장하는 제한적인 가능성이 있습니다. 따라서 대규모 실험의 경우 다른 기증자의 배치를 사용해야 하므로 게놈 차이와 배치 간 변형이 발생합니다. 둘째, 몇 개의 대고 후에, 1차 내피 세포는 일반적으로 시험관 내 배양 시 관련 성질을상실한다11,12.
인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 파생된 내피 세포는 유망한 대안입니다: 그(것)들은 1 차적인 세포를 닮습니다, 그러나 또한 정확한 게놈 편집을 할 수 있는 더 안정된 유전자형을 가진. 더욱이, iPSCs는 자가 갱신할 수 있고 따라서 iPSC 유래 세포가 시험관 내 스크리닝모델(13)내의 사용을 위한 1차 세포에 대한 매력적인 대안이 되도록 거의 무제한으로 확장될 수 있다.
여기서, 우리는 표준화된 고처리량 미세유체 세포 배양 플랫폼에서 내피 세포를 배양할 수 있는 3D 마이크로혈관으로 배양하는 방법을 설명한다. 관류는 장치를 로커 플랫폼에 배치하여 적용되어 강력한 작동을 보장하고 분석의 확장성을 높입니다. 미세 혈관이 지속적으로 관질되고 혈관 신생 인자의 구배에 노출됨에 따라 혈관 신생 발아는 보다 생리학적 관련이있는 세포 미세 환경에서 연구됩니다. 프로토콜은 (1 차) 내피 세포의 많은 다른 소스와 호환되는 동안14,15,우리는이 분석의 표준화를 증가시키고 통합을 용이하게하기 위해 인간 iPSC 파생 된 EC를 사용하는 데 초점을 맞추십시오. 혈관 약물 연구 내에서.
이 방법은 견고하고 확장 가능한 미세 유체 세포 배양 플랫폼 내에서 40개의 투과성 내피 미세 혈관의 배양을 설명합니다. 기존의 2D 및 3D 세포 배양 방법에 비해, 이 방법은 그라데이션및 연속 관류를 포함하는 생리학적 관련 세포 미세 환경이 스크리닝을 위한 적절한 처리량과 3D 세포 배양과 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다. 목적.
비교 가능한 미세 유체 성 검사에 비해 주요 장점 중 하나는이 방법은 관류펌프에 의존하지 않고 로커 플랫폼을 사용하여 모든 미세 유체 단위에서 동시에 지속적인 관류를 유도한다는 것입니다. 이렇게 하면 로커 플랫폼에 플레이트를 쌓을 수 있습니다. 중요한 것은, 모든 미세 유체 단위는 개별적으로 주소 지정 가능한 상태로 유지되며, 이를 통해 이 방법은 투여 량-응답 곡선의 생성을 포함하여 약물 스크리닝 내에서 구현될 수 있습니다. 또한 펌프가 없으면 이미징 및 중간 교체가 훨씬 간단하며(교차) 오염 위험이 적습니다.
이 방법의 또 다른 장점은 표준화된 사전 제조 된 플랫폼을 사용하는 반면, 유사한 미세 유체 세포 배양 플랫폼은 최종 사용자에 의해 제작되어야한다는 것입니다. 이 가용성은 표준화로 이끌어 내는 그밖 학술 및 약학 연구 단 중 이 분석의 채택을 용이하게 합니다. 또한, 미세 유체 프로토타입과 달리 384웰 플레이트 인터페이스는 현재 실험실 장비(예: 지피레이터, 플레이트 핸들러 및 다중 채널 파이펫)와의 호환성을 보장하여 현재 스크리닝 인프라 내에서 통합을 용이하게 합니다. .
이 분석 을 수행 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 콜라겐-1 젤은 젤 채널을 완전히 채워야 합니다. 겔 로딩 동안, 이 충전물은 관찰창(그림 2a)을통해 미세 유체 채널을 검사하거나 플레이트를 거꾸로 뒤집어 관찰할 수 있습니다(그림 1a와같이). 채우는 동안 콜라겐 젤은 인접한 관류 채널로 흐르지 않고 중앙 채널에 남아 있어야합니다. 우리는 콜라겐-1 젤의 품질이 적절한 분석 성능을 위해 중요하다는 것을 발견했습니다. 점도가 너무 높은 콜라겐-1 배치는 젤 채널의 불완전한 충진으로 이어질 것입니다. 37°C에서 중합10분 후, 겔은 균일하고 명확해야 한다. 콜라겐-1이 제대로 저장되지 않으면(예: 냉장고의 온도 변동으로 인해) 콜라겐은 명확하게 보이는 섬유 형성으로 채널 내에서 중합됩니다. 이것은 혈관 신생 인자를 첨가하지 않고 젤에 EC를 침범 할 수 있지만 적절한 루멘 발달없이 발생할 수 있습니다.
세포가 시드되면, fibronectin 코팅 용액은 코팅 용액으로 채워진 미세 유체 채널만 남기고 우물에서 제거됩니다. 미세 유체 채널에서 코팅 용액의 흡인은 겔 중단 또는 젤 흡인을 일으킬 수 있습니다. 셀 서스펜션은 이 코팅 용액을 교체/대체해야 합니다. 이는 셀 서스펜션이 수동 펌핑 방법을 사용하여 시드될 때 가장 효과적입니다.
마이크로 혈관이 젤에 대해 안정적인 단층을 형성함에 따라, 이러한 작은 차이는 합류에 도달하는 데 필요한 다른 시간만 을 초래합니다. 따라서, 분석 시작점은 배양 시간이 아닌 합류에 의해 결정된다. 필요한 경우, 겔에 대하여 명확한 단층이 형성될 때까지 배양 시간을 연장할 수 있다.
우물 내에서 기포는 우물의 잘못된 충진에 의해 포획될 수 있습니다(그림 2b참조). 이러한 기포는 장치가 로커 플랫폼에 배치된 경우에도 매체의 흐름을 제한하고 마이크로 용기의 붕괴와 부적절한 그라데이션 형성을 초래합니다. 우물의 측면 벽에 파이펫 팁을 누르면 완전히 우물을 채우는 성공을 증가시킬 것이다. 기포가 우물 내에 갇혀있는 경우 멸균 피펫 팁을 유리 바닥에 부드럽게 삽입하여 제거 할 수 있습니다. 기포는 미세 유체 채널 내에서도 발생할 수 있습니다. 매폐가 우물에서 제거되면 30 분 후에 미세 유체 채널에서 매체의 증발이 눈에 띄게됩니다 (채널 내의 마이크로 리터 부피로 인해). 따라서, 배지 변화는 바람직하게는 가능한 한 빨리 수행된다. 증발 배지가 있는 채널에 배지를 추가하면 기포가 미세 유체 채널 내에 포동포동하게 됩니다. 미세 유체 채널 내의 이러한 기포는 P20 파이펫을 입구 또는 출구에 직접 배치하고 반대쪽 우물에서 미세 유체를 통해 매체를 강제로 제거 할 수 있습니다. 기포를 성공적으로 제거하면 다른 우물의 부피가 작지만 눈에 띄게 감소합니다. 표 1에는 일반적인 오류와 문제 해결 방법을 나열합니다.
로커 플랫폼은 순차적 시간 간격으로 사용자를 이미지로 제한하기 때문에 연속 이미징이 필요한 경우 펌프의 부족이 제한됩니다. 또한,이 플랫폼에서 매체의 관류는 전단 응력의 낮은 수준의 양방향 흐름으로 구성되어 있으며, 생체 내 혈관 구조는 전단 응력의 높은 수준으로 단방향 흐름에 노출됩니다. 우리는 혈관 신생 발아와 관련하여 양방향 흐름의 부정적인 영향을 관찰하지 않지만, 흐름은 중요한 생체 역학 자극이며 바람직하게는 제어됩니다. 그러나 시판되는 펌프 셋업이 있지만 384웰 플레이트와의 인터페이싱은 여전히 까다롭고 펌프 설정은 이 분석의 확장성을 심각하게 저해합니다.
혈관 신생 발아를 연구하기 위해 iPSC-EC를 사용할 수있는 가능성은 질병 모델링 및 약물 연구에서 새로운 기회를 열어줍니다. 1차 ECs와 는 달리, 이들 세포는 안정적인 유전자형을 가진 거의 무한한 양으로 생성될 수 있고 게놈 편집 기술을 사용하여, 세포는 유전자 녹아웃 및 노크인을 포함하는 생성될 수 있다. 그러나 iPSC와 EC를 구별하는 프로토콜은 비교적 새로운 프로토콜이므로 기본 EC를 가장 잘 반영하는 iPSC-EC와 EC의 하위 유형이 생성될 수 있는 것이 무엇인지는 아직 불분명합니다. 또한 관련성에 대한 의문은 여전히 남아 있습니다. 예를 들면, iPSC-EC는 아직도 내피 세포를 위해 전형적인 가소성을 전시합니까? 그리고 iPSC 유래 세포는 어느 정도까지 그들의 세포 미세 환경에 반응하고 상호 작용합니까? 여기에 제시된 표준화된 플랫폼은 iPSC 유래 EC의 사용을 시험관 내에서 더욱 검증하기 위해 이러한 질문 중 일부에 답하는 데 사용될 수 있습니다.
이 분석에 대한 가장 똑바른 미래 방향은 pericytes 및 대식세포와 같은 혈관 신생 동안 중요한 역할을하는 다른 세포 유형의 통합이 될 것입니다. 이것은 새싹 사이 건대 증 또는 모세 혈관 형성 후에 pericytes의 준수 도중 대식세포의 역할을 공부하는 기능을 촉진할 것입니다. 또한, 세포외 기질(예를 들어, 혈관과 결합될 수 있는 근위수관 및 소장과 같은 뉴런 및 다양한 상피 구조의 배양을 보여주었다)에 대하여 다양한 다른 세포 유형을 배양할 수 있다. 이 방법을 사용하여 생성 된 침대. 마지막으로, 그들의 정의된 조성물이 분석의 표준화를 더욱 증가시키고 세포 매트릭스 상호작용에 영향을 미치는 강성 및 결합 동기의 튜닝을 허용하기 때문에 합성 하이드로겔에서 혈관신생 발아를 연구하는 것이 흥미로바일 것이다.
결론적으로, 이 방법은 iPSC 유래 EC의 실현 가능성을 표준화되고 확장 가능한 3D 혈관조인성 분석법으로 보여주며, 이 에 통합될 수 있는 견고성과 확장성을 겸비한 플랫폼에서 생리학적 관련 배양 조건을 결합한 분석 약물 스크리닝 인프라.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 네덜란드 보건 연구 개발 기구 (ZonMw)와 네덜란드 심장 재단 CVON 컨소시엄 보조금의 ‘미어 케니스 만난 마인더 디에렌’프로그램 (프로젝트 번호 114022501)에서 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원됩니다 다시.
0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
Basal culture medium | NCardia | ||
Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
dPBS | Gibco | 14190-094 | |
Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
HBSS | Gibco | 14025-050 | |
Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |