Denna studie introducerar och beskriver protokoll för att härleda två specifika mänskliga neurala organoider som en relevant och korrekt modell för att studera 1) mänskliga glioblastoma utveckling inom mänskliga neurala organoider uteslutande hos människor och 2) neuron dopaminerga differentiering generera en tredimensionell Organoid.
Avsaknaden av relevanta in vitro-neurala modeller är ett viktigt hinder för medicinska framsteg för neuropatier. Etablering av relevanta cellulära modeller är avgörande både för att bättre förstå de patologiska mekanismerna för dessa sjukdomar och identifiera nya terapeutiska mål och strategier. För att vara relevant, en in vitro-modell måste reproducera de patologiska egenskaper hos en mänsklig sjukdom. Emellertid, i samband med neurodegenerativa sjukdomar, en relevant in vitro-modell bör ge neurala cell Replacement som en värdefull terapeutisk möjlighet.
En sådan modell skulle inte bara tillåta screening av terapeutiska molekyler utan också kan användas för att optimera neurala protokollet differentiering [till exempel, i samband med transplantation vid Parkinsons sjukdom (PD)]. Denna studie beskriver två in vitro-protokoll av 1) mänskliga glioblastoma utveckling inom en mänsklig neurala organoider (NO) och 2) neuron dopaminerga (DA) differentiering generera en tredimensionell (3D) Organoid. För detta ändamål, ett väl standardiserat protokoll inrättades som gör att produktionen av storleks-kalibrerade neurospheres härrör från mänskliga embryonala stamceller (hESC) differentiering. Den första modellen kan användas för att avslöja molekylära och cellulära händelser som inträffar under i glioblastoma utveckling inom neurala Organoid, medan DA Organoid inte bara representerar en lämplig källa till DA neuroner för cellterapi vid Parkinsons sjukdom men också kan användas för drogtester.
Världshälsoorganisationen (WHO) klassificerar astrocytom som låggradig (grad I till II) eller hög grad (grad III och IV). Glioblastoma multiforme (GBM) är en astrocytom grad IV, den mest dödliga av primära hjärntumörer, som är resistent mot alla nuvarande former av behandlingar1. Trots standard-of-Care terapi inklusive neurokirurgi, kemoterapi, och strålbehandling, GBM förblir dödlig och den 15-månaders total överlevnad har inte förändrats dramatiskt under de senaste 15 åren2. För att göra betydande framsteg i förståelsen av GBM-patogenesen är det viktigt att använda relevanta modeller. Hittills har studien av GBM förlitat sig på cellinjer, gnagare organotypic skivor, och xenotransplantation av patient-härledda celler till möss eller transgena möss utveckla spontana tumörer3,4. Även om dessa modeller har varit användbara för att studera hjärnmetastaser och tumör aggressivitet, de begränsas av skillnader mellan arter, och resulterande slutsatser kan vara felaktigt översättas till mänskliga vävnader. Dessutom, befintliga modeller med mänskliga celler är också begränsade av frånvaron av värd vävnad/tumörinteraktioner3,4. Experimentella modeller är avgörande för översättningen från grundläggande vetenskap till terapeutiska mål. Därför, beskriver ett protokoll för att producera in vitro humana neurala organoider Co-odlade med GBM-initierande celler (GICs) kan ge ett relevant system som härmar morfologiska och funktionella egenskaper hos GBM utveckling. Detta system återger några in vivo funktioner i GBM developmentsåsom diffus migration av invaderande celler och nekros områden, och det belyser genuttryck som är relevanta för tumörbiologi. Som tidigare avslöjat, vissa kritiska mikroRNAs induceras under GIC utveckling inom 3D nervvävnad5,6.
PD är en stor neurodegenerativ sjukdom och i samband med degeneration av flera neuronala subtyper7. Även om en progressiv debut av symtom (t. ex., bradykinit, asymmetrisk vila tremor, stelhet och hållning instabilitet) karakteriserar sjukdomen, dess exakta etiologi är inte klart etablerad. Faktum är att många studier har belyst belägg för att stora riskfaktorer kan bero på en kombination av genetiska och miljömässiga faktorer. Parkinsonian symtom är förknippade med den bilaterala degeneration av dopaminerga neuroner i substancia Nigra (SN), vilket leder till försvinnandet av dopaminerga (da) axoner projicerar till striatum8,9. Därför, minskningen av striatala dopaminnivåer är korrelerad med progression av motorisk dysfunktion hos PD-patienter. Dopaminerga neuroner innehåller tyrosin hydroxylas (TH), ett nyckel enzym i syntesen av katekolaminerga signalsubstanser som omvandlar aminosyran L-tyrosin till L-3, 4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA, en dopamin föregångare) till dopamin10. Tidig förlust av TH aktivitet följt av en nedgång i TH proteinuttryck är ett kännetecken för PD.
Denna studie beskriver två protokoll med hjälp av mänskliga neurala organoider, med en särskilt inriktad mot en midbrain-liknande fenotyp berikad med TH-positiva celler.
En av de mest kritiska aspekterna av detta protokoll omfattar underhåll av hESC pluripotensen under cellodling och noggrann övervakning av sfärerna och neurala Organoid morfologi. hESCs är mycket känsliga, och varje manipulation kan leda till tidig okontrollerad differentiering och celldöd. För att öka experimentell reproducerbarhet och undvika förekomsten av onormala karyotyp händelser, det rekommenderas att frysa flera partier av hESCs vid den lägsta passagen efter validering av deras kromosom stabilitet. Dessutom, det rekommenderas att Tina en ny injektionsflaska för varje experiment och kontrollera beteendet hos cellerna varje dag. Om sfärerna är mindre refraktiv med onormal högre storlek, kommer de sannolikt att börja aggregera och dö.
En förbättring på detta system är antingen perfusion eller genomföra ett vaskulariserad system (genom att tillsätta endotelceller eller inom en 3D fluidic microchip)12,13. Men att kontrollera tjockleken på neurala Organoid (≤ 300 μm) möjliggör effektiv passiv perfusion av syre och näringsämnen och förebygger nekros. En annan förbättring är införandet av immunceller (microglia). Med dessa begränsningar i åtanke, neurala organoider plus ett GIC-system kan vara ett relevant verktyg av flera skäl. Först, detta system tillåter Drug screening för att övervaka hur en terapeutisk förening kan påverka en Organoid eller tumör cell. För det andra, cell-till-cell interaktioner kan studeras, och mikro-miljö bestämningsfaktorer underliggande enskilda och kollektiva invasionerna kan visualiseras och utforskas5,6,13.
I samband med Parkinsons sjukdom, en neural Organoid berikad i DA nervceller kan representera en relevant och korrekt 3D-modell för att studera sjukdomsutveckling. I tidigare studier har Parkinsons patient-derived inducerade pluripotenta stamceller differentierat mot DA neuroner har använts för att studera de drabbade neuronala subtyper. Notera, vissa sjukdomsrelaterade fenotyper såsom ansamling av α-Synuclein och känslighet för oxidativ stress har observerats14,15. Dessutom kan den neurala Organoid användas som ett verktyg för att avskärma terapeutiska molekyler. Emellertid, specifika och relevanta utläsningar bör inrättas för att utvärdera da neuron överlevnad och funktionalitet, såsom dopamin produktion och elektrofysiologiska aktivitet. Sammantaget ger detta protokoll två standardiserade och korrekta Stem cell-baserade metoder för att generera neurala organoider.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar La Ligue genevoise contre le cancer (Genève, Schweiz), ISREC Foundation (Lausanne, Schweiz), och Clayton Foundation for Research (Houston, TX, USA) för ekonomiskt stöd. Dessutom författarna tackar HES-HO och Wyss Center för ekonomiskt stöd. Vi tackar Krauses labb för hjälpsamma diskussioner och stöd och Dr Halah Kutaish för korrekturläsning.
6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |