Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.
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Artigo de método
Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor
Neste artigo
Resumo
Resumo
A neurociência é o estudo de como as células do cérebro mediam várias funções. A expressão da proteína de medição nos neurônios e na glia é fundamental para o estudo da neurociência, pois a função celular é determinada pela composição e atividade das proteínas celulares. Neste artigo, nós descrevemos como Immunocytochemistry pode ser combinado com a exploração de alta resolução infravermelho próximo para fornecer uma medida semiquantitativa da expressão da proteína em regiões distintas do cérebro. Esta técnica pode ser usada para a única ou expressão dobro da proteína na mesma região do cérebro. A medição de proteínas desta forma pode ser usada para obter uma mudança relativa na expressão protéica com uma manipulação experimental, assinatura molecular de aprendizado e memória, atividade em vias moleculares e atividade neural em várias regiões cerebrais. Usando as proteínas corretas e a análise estatística, a conectividade funcional entre as regiões cerebrais também pode ser determinada. Dada a facilidade de implementação de imunocitoquímica em um laboratório, usando Immunocytochemistry com varredura de alta resolução infravermelho próximo pode expandir a capacidade do neurocientista para examinar os processos neurobiológicos em um nível de sistemas.
Introdução
O estudo da neurociência diz respeito a uma investigação de como as células do cérebro mediam funções específicas1. Estes podem ser de natureza celular, como a forma como as células glia conferem imunidade no sistema nervoso central ou podem envolver experimentos que visam explicar como a atividade dos neurônios no hipocampo dorsal leva à navegação espacial. Em um sentido amplo, a função celular é determinada pelas proteínas que são expressas em uma célula e a atividade dessas proteínas2. Como resultado, medir a expressão e/ou atividade de proteínas nas células cerebrais são críticas para o estudo da neurociência.
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Protocolo
O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Delaware. Os ratos masculinos de Sprague Dawley aproximadamente 55 – 75 dias velhos foram usados para este protocolo.
1. extração cerebral e preparação de tecidos
- Anestesie o rato com isoflurano na câmara de indução anestésica até que o rato não apresente mais uma resposta à pinça do pé.
- Sacrifique ratos através da decapitação rápida usando uma guilhotina.
- Corte a pele no crânio posterior ao anterior e desobstruído da parte superior do crânio.
- Use rongeurs para remover cuidadosamente a p....
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Resultados
Antes de usar a varredura de alta resolução para immunohistochemistry, uma deve verificar que o protocolo trabalha. Isto pode ser conseguido usando um ensaio de validação onde seções cerebrais do mesmo animal são incubadas com anticorpos primários e secundários, anticorpo secundário sozinho, ou nenhum anticorpo primário ou secundário. Os resultados para tal ensaio de validação são mostrados na Figura 2. Nesta reação nós estávamos detectando o gene adiantado i.......
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Discussão
Os resultados apresentados neste artigo mostram que o Immunocytochemistry próximo-infravermelho em combinação com a exploração de alta resolução pode ser usado para obter medidas Semiquantitativas da expressão da proteína no tecido de cérebro. Ele também pode ser usado para rotular duas proteínas simultaneamente na mesma região do cérebro. Nós usamos previamente immunohistochemistry próximo-infravermelho para medir a expressão adiantada imediata do gene em regiões múltiplas do cérebro9,10
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
A pesquisa neste relatório foi financiada por uma subvenção-alvo dos NIGMS (1P20GM103653) concedido à DK.
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Materiais
Câmara de indução de anestesia cerebral Imunohistoquímica
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| de extração | |||
| Kent Scientific | VetFlo-0530SM | ||
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | usado para remover a parte de trás do crânio |
| Tesoura de dissecação delicada | Fischer Scientific | 08-951-5 | usado para cortar para cima ao longo da linha média do crânio |
| Micro Espátula | Fischer Scientific | 21-401-5 | usado para retirar o cérebro |
| Lâminas de Microscópio de Vidro | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Reação | |||
| Triton X-100 | Usado como detergente suave para permeabilizar células após fixação em Paraformaldeído, também usado como detergente suave em combinação com soro do hospedeiro e anticorpo secundário | ||
| Tween-20 | Usado como uma pequena quantidade de detergente adicionado ao TBS para processar TBS-T após lâminas de lamínula com anticorpo primário | ||
| Scanner Licor Odyssey | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Estúdio de Imagem | Licor Biotechnology Inc. |
Referências
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al.
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Reimpressões e permissões
