Vi introduserer en reproduserbar og stabil optisk opptaks metode for hjerne skiver ved hjelp av spennings følsomt fargestoff. Artikkelen beskriver spennings følsomme fargestoff flekker og opptak av optiske signaler ved hjelp av konvensjonelle hippocampus Slice forberedelser.
Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (VSD) tenkelig av hjerne skive forberedelser er en nyttig verktøyet å vurdere det funksjonell connectivity inne neural kretsløpene. På grunn av brøk endring i lyssignalet, har det vært vanskelig å bruke denne metoden som en kvantitativ analysen. Denne artikkelen beskriver spesielle optikk og Slice håndtering systemer, som gjør denne teknikken stabil og pålitelig. Denne artikkelen demonstrerer stykket håndtering, farging, og innspillingen av VSD-beiset hippocampus skiver i detalj. Systemet opprettholder fysiologiske forhold i lang tid, med gode flekker, og hindrer mekaniske bevegelser av stykket under opptakene. Videre gjør det farging av skiver med en liten mengde av fargestoff. Optikk oppnå høy numerisk blenderåpning ved lav forstørrelse, noe som gjør opptak av VSD signal ved maksimal bildefrekvens på 10 kHz, med 100 piksel x 100-piksel romlig oppløsning. På grunn av høy bildefrekvens og romlig oppløsning, tillater denne teknikken anvendelse av post-innspillingen filtre som gir tilstrekkelig signal-til-støy-forhold for å vurdere endringer i nevrale kretser.
Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (vsd) tenkelig av bulk-flekkete hjerne skive forberedelser har bli en nyttig kvantitative verktøyet å vurdere dynamikken i neural kretser1,2,3,4 . Etter analysen av endringene i optiske egenskaper på grunn av membran eksitasjon5,6,7, VSD Imaging ble først beskrevet i begynnelsen av 1970-tallet av Cohen ogandre 6,8, 9.; Det er en egnet metode for å overvåke hjernens funksjoner i sanntid som fargestoff direkte sonder membranen potensielle endringer (dvs. den primære signal av neurons).
De tidligste VSDs hadde den ønskelige egenskaper for å forstå hjernens system, slik som en rask tid-konstant å følge den raske Kinetics av neuronal membran potensielle hendelser, og linearitet med endring i membran potensial9, 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser , 15. ligner på andre Imaging eksperimenter, krever denne teknikken et bredt spekter av spesifikke stemming, slik som kameraer, optikk, programvare, og skive fysiologi, for å oppnå de ønskede resultater. På grunn av disse tekniske fallgruvene, de forventede fordelene ved første innsats ikke nødvendigvis materialisere for de fleste laboratorier som ikke er spesialister på denne teknikken.
Den primal årsaken til den tekniske problemer var lav følsomhet i VSD mot membranen potensielle endringen når den brukes til bulk farging av Slice forberedelser. Størrelsen på det optiske signalet (dvs. brøk endringen i fluorescens) er vanligvis 10-4-10-3 av kontrollen (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskala av membran potensiell endring i en Nevron er ca millisekunder til noen hundrevis av millisekunder. For å måle endringer i membranen potensialet i Nevron, kameraet brukes for innspillingen skal kunne erverve bilder med høy hastighet (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomheten til VSD og hastigheten som trengs for å følge det nevrale signalet krever en stor mengde lys som skal samles på kameraet i høy hastighet, med et høyt signal-til-støy-forhold (S/N)2,16.
Optikk av opptaks systemet er også et kritisk element for å sikre innsamling av tilstrekkelig lys og for å forbedre S/N. Forstørrelsen oppnås ved optikk er ofte overdrevent lav, for eksempel 1X til 10X, for å visualisere en lokal funksjonell nevrale krets. For eksempel, for å visualisere dynamikken i hippocampus krets, en forstørrelse på ca 5 ville være egnet. Slike lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor vil avansert optikk være gunstig for slike opptak.
I tillegg er stykket fysiologi også viktig. Siden Imaging analyse krever skiver for å være intakt, forsiktig skive håndtering er nødvendig17. Videre er tiltak tatt for å opprettholde skive levedyktighet for en lengre tid er viktig18.
Denne artikkelen beskriver protokollen for utarbeidelse av skiver, VSD farging og målinger. Artikkelen skisserer også forbedringer til VSDs, tenkelig enhet og optikk, og andre ytterligere forbedringer til det eksperimentelle systemet som har aktivert denne metoden skal brukes som en grei, kraftig og kvantitativ analysen for å visualisere modifikasjon av hjernensfunksjoner19,20,21,22,23,24,25. Teknikken kan også bli mye brukt for langsiktige potensiering i CA1 området av hippocampus skiver1. Videre er denne teknikken også nyttig i optisk innspilling av membran potensialer i en enkelt nerve celle26.
Stykket fysiologi er avgjørende for å samle riktig signal. Bruken av ring membran filtersystemet i denne protokollen sikrer at stykket forblir sunt og un-forvrengt gjennom prosedyren2,16,17. Andre systemer kan brukes til å beholde skive fysiologi under innspillingen, men stykket bør ikke bli deformert til enhver tid som tenkelig behov hver eneste del av stykket for å være sunn. Det ring-membran filtersystemet er også bedr…
The authors have nothing to disclose.
TT mottok JSP KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 og JP15K00413) fra MEXT og tilskudd fra helse-, arbeids-og Velferdsdepartementet (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] og H30 [18062156]). Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk språk redigering.
High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |