Bred-åker enkelt-Foton optisk innspillingen inne hjerne skive benytter Voltage-følsom Dye
Summary
Vi introduserer en reproduserbar og stabil optisk opptaks metode for hjerne skiver ved hjelp av spennings følsomt fargestoff. Artikkelen beskriver spennings følsomme fargestoff flekker og opptak av optiske signaler ved hjelp av konvensjonelle hippocampus Slice forberedelser.
Abstract
Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (VSD) tenkelig av hjerne skive forberedelser er en nyttig verktøyet å vurdere det funksjonell connectivity inne neural kretsløpene. På grunn av brøk endring i lyssignalet, har det vært vanskelig å bruke denne metoden som en kvantitativ analysen. Denne artikkelen beskriver spesielle optikk og Slice håndtering systemer, som gjør denne teknikken stabil og pålitelig. Denne artikkelen demonstrerer stykket håndtering, farging, og innspillingen av VSD-beiset hippocampus skiver i detalj. Systemet opprettholder fysiologiske forhold i lang tid, med gode flekker, og hindrer mekaniske bevegelser av stykket under opptakene. Videre gjør det farging av skiver med en liten mengde av fargestoff. Optikk oppnå høy numerisk blenderåpning ved lav forstørrelse, noe som gjør opptak av VSD signal ved maksimal bildefrekvens på 10 kHz, med 100 piksel x 100-piksel romlig oppløsning. På grunn av høy bildefrekvens og romlig oppløsning, tillater denne teknikken anvendelse av post-innspillingen filtre som gir tilstrekkelig signal-til-støy-forhold for å vurdere endringer i nevrale kretser.
Introduction
Bred-åker enkelt Foton Voltage-følsom Dye (vsd) tenkelig av bulk-flekkete hjerne skive forberedelser har bli en nyttig kvantitative verktøyet å vurdere dynamikken i neural kretser1,2,3,4 . Etter analysen av endringene i optiske egenskaper på grunn av membran eksitasjon5,6,7, VSD Imaging ble først beskrevet i begynnelsen av 1970-tallet av Cohen ogandre 6,8, 9.; Det er en egnet metode for å overvåke hjernens funksjoner i sanntid som fargestoff direkte sonder membranen potensielle endringer (dvs. den primære signal av neurons).
De tidligste VSDs hadde den ønskelige egenskaper for å forstå hjernens system, slik som en rask tid-konstant å følge den raske Kinetics av neuronal membran potensielle hendelser, og linearitet med endring i membran potensial9, 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser , 15. ligner på andre Imaging eksperimenter, krever denne teknikken et bredt spekter av spesifikke stemming, slik som kameraer, optikk, programvare, og skive fysiologi, for å oppnå de ønskede resultater. På grunn av disse tekniske fallgruvene, de forventede fordelene ved første innsats ikke nødvendigvis materialisere for de fleste laboratorier som ikke er spesialister på denne teknikken.
Den primal årsaken til den tekniske problemer var lav følsomhet i VSD mot membranen potensielle endringen når den brukes til bulk farging av Slice forberedelser. Størrelsen på det optiske signalet (dvs. brøk endringen i fluorescens) er vanligvis 10-4-10-3 av kontrollen (F0) signal under fysiologiske forhold. Tidsskala av membran potensiell endring i en Nevron er ca millisekunder til noen hundrevis av millisekunder. For å måle endringer i membranen potensialet i Nevron, kameraet brukes for innspillingen skal kunne erverve bilder med høy hastighet (10 kHz til 100 Hz). Den lave følsomheten til VSD og hastigheten som trengs for å følge det nevrale signalet krever en stor mengde lys som skal samles på kameraet i høy hastighet, med et høyt signal-til-støy-forhold (S/N)2,16.
Optikk av opptaks systemet er også et kritisk element for å sikre innsamling av tilstrekkelig lys og for å forbedre S/N. Forstørrelsen oppnås ved optikk er ofte overdrevent lav, for eksempel 1X til 10X, for å visualisere en lokal funksjonell nevrale krets. For eksempel, for å visualisere dynamikken i hippocampus krets, en forstørrelse på ca 5 ville være egnet. Slike lav forstørrelse har lav fluorescens effektivitet; Derfor vil avansert optikk være gunstig for slike opptak.
I tillegg er stykket fysiologi også viktig. Siden Imaging analyse krever skiver for å være intakt, forsiktig skive håndtering er nødvendig17. Videre er tiltak tatt for å opprettholde skive levedyktighet for en lengre tid er viktig18.
Denne artikkelen beskriver protokollen for utarbeidelse av skiver, VSD farging og målinger. Artikkelen skisserer også forbedringer til VSDs, tenkelig enhet og optikk, og andre ytterligere forbedringer til det eksperimentelle systemet som har aktivert denne metoden skal brukes som en grei, kraftig og kvantitativ analysen for å visualisere modifikasjon av hjernensfunksjoner19,20,21,22,23,24,25. Teknikken kan også bli mye brukt for langsiktige potensiering i CA1 området av hippocampus skiver1. Videre er denne teknikken også nyttig i optisk innspilling av membran potensialer i en enkelt nerve celle26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stykket fysiologi er avgjørende for å samle riktig signal. Bruken av ring membran filtersystemet i denne protokollen sikrer at stykket forblir sunt og un-forvrengt gjennom prosedyren2,16,17. Andre systemer kan brukes til å beholde skive fysiologi under innspillingen, men stykket bør ikke bli deformert til enhver tid som tenkelig behov hver eneste del av stykket for å være sunn. Det ring-membran filtersystemet er også bedr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT mottok JSP KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 og JP15K00413) fra MEXT og tilskudd fra helse-, arbeids-og Velferdsdepartementet (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] og H30 [18062156]). Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk språk redigering.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Tominaga, T., Ichikawa, M. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
