Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff
Summary
Wir führen eine reproduzierbare und stabile optische Aufzeichnungsmethode für Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff ein. Der Artikel beschreibt spannungsempfindliche Farbstofffärbung und Aufzeichnung optischer Signale mit herkömmlichen Hippocampus-Scheibenpräparaten.
Abstract
Die Wide-Field Single Photon Voltage-Sensitive Dye (VSD)-Bildgebung von Hirnscheibenpräparaten ist ein nützliches Werkzeug, um die funktionelle Konnektivität in neuronalen Schaltkreisen zu bewerten. Aufgrund der bruchstückhaften Veränderung des Lichtsignals war es schwierig, diese Methode als quantitativen Test zu verwenden. Dieser Artikel beschreibt spezielle Optiken und Slice-Handling-Systeme, die diese Technik stabil und zuverlässig machen. Der vorliegende Artikel zeigt die Schnittbearbeitung, Färbung und Aufzeichnung der VSD-befleckten Hippocampusscheiben im Detail. Das System hält die physiologischen Bedingungen für eine lange Zeit, mit guter Färbung, und verhindert mechanische Bewegungen der Scheibe während der Aufnahmen. Darüber hinaus ermöglicht es die Färbung von Scheiben mit einer kleinen Menge des Farbstoffs. Die Optik erreicht eine hohe numerische Blende bei geringer Vergrößerung, die die Aufzeichnung des VSD-Signals bei einer maximalen Bildrate von 10 kHz mit einer räumlichen Auflösung von 100 Pixelx x 100 Pixel ermöglicht. Aufgrund der hohen Bildrate und räumlichen Auflösung ermöglicht diese Technik die Anwendung der Post-Recording-Filter, die ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis bieten, um die Veränderungen in neuronalen Schaltkreisen zu bewerten.
Introduction
Wide-Field Single Photon Voltage-Sensitive Dye (VSD) Imaging of bulk-stained brain slice preparations has become a useful quantitative tool to assess the dynamics of neural circuits1,2,3,4 . Nach der Analyse der Veränderungen der optischen Eigenschaften durch Membrananregung5,6,7wurde DIE VSD-Bildgebung erstmals in den frühen 1970er Jahren von Cohen und anderen6,8, 9. ; es ist eine geeignete Methode, um die Gehirnfunktionen in Echtzeit zu überwachen, da der Farbstoff direkt die Membranpotentialveränderungen (d.h. das primäre Signal der Neuronen) untersucht.
Die frühesten VSDs besaßen die wünschenswerten Eigenschaften, um das Gehirnsystem zu verstehen, wie eine schnelle Zeitkonstante, um die schnelle Kinetik neuronaler Membranpotentialereignisse zu verfolgen, und Linearität mit der Veränderung des Membranpotentials9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Ähnlich wie bei anderen bildgebenden Experimenten erfordert diese Technik eine breite Palette spezifischer Abstimmungen, wie Kameras, Optik, Software und Slice-Physiologie, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Aufgrund dieser technischen Fallstricke waren die erwarteten Vorteile bei den ersten Bemühungen für die meisten Laboratorien, die sich nicht auf diese Technik spezialisiert hatten, nicht unbedingt eingetreten.
Die Urursache der technischen Schwierigkeit war die geringe Empfindlichkeit des VSD gegenüber der Membranpotenzialänderung, wenn sie auf Diemassenfärbung von Scheibenpräparaten angewendet wurde. Die Größe des optischen Signals (d.h. die fraktionierte Veränderung der Fluoreszenz) beträgt in der Regel 10-4-10-3 des Steuersignals (F0) unter physiologischen Bedingungen. Die Zeitskala der Membranpotentialänderung in einem Neuron beträgt ungefähr Millisekunden bis wenige hundert Millisekunden. Um die Veränderungen des Membranpotenzials des Neurons zu messen, sollte die kamera, die für die Aufnahme verwendet wird, in der Lage sein, Bilder mit hoher Geschwindigkeit (10 kHz bis 100 Hz) zu erfassen. Die geringe Empfindlichkeit von VSD und die Geschwindigkeit, die benötigt wird, um dem neuronalen Signal zu folgen, erfordert eine große Menge an Licht, um an der Kamera mit hoher Geschwindigkeit gesammelt zu werden, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (S/N)2,16.
Die Optik des Aufzeichnungssystems ist auch ein entscheidendes Element, um die Erfassung von ausreichend Licht zu gewährleisten und S/N zu verbessern. Die von der Optik erreichte Vergrößerung ist oft zu niedrig, z. B. 1X bis 10X, um einen lokalen funktionellen neuronalen Schaltkreis zu visualisieren. Um beispielsweise die Dynamik des Hippocampus zu visualisieren, wäre eine Vergrößerung von etwa 5 geeignet. Eine solche geringe Vergrößerung hat eine geringe Fluoreszenzeffizienz; daher wäre eine fortschrittliche Optik für eine solche Aufnahme von Vorteil.
Darüber hinaus ist auch die Scheibenphysiologie von wesentlicher Bedeutung. Da die bildgebende Analyse erfordert, dass die Slices intakt sind, ist eine sorgfältige Schnittverarbeitung erforderlich17. Darüber hinaus sind Maßnahmen, die ergriffen werden, um die Realisierbarkeit der Scheibe für einen längeren Zeitpunkt zu erhalten, wichtig18.
Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll zur Vorbereitung von Scheiben, VSD-Färbung und Messungen. Der Artikel beschreibt auch die Verbesserungen der VSDs, des Bildgebungsgeräts und der Optik sowie andere zusätzliche Verfeinerungen des experimentellen Systems, die es ermöglicht haben, diese Methode als einfache, leistungsstarke und quantitative Assay zur Visualisierung der Veränderung der Gehirnfunktionen19,20,21,22,23,24,25. Die Technik kann auch weit verbreitet für langfristige Potenzierung im CA1-Bereich von Hippocampus-Scheiben1verwendet werden. Darüber hinaus ist diese Technik auch bei der optischen Erfassung von Membranpotentialen in einer einzelnen Nervenzelle26nützlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Scheibenphysiologie ist entscheidend, um das richtige Signal zu sammeln. Die Verwendung des Ring-Membran-Filtersystems in diesem Protokoll stellt sicher, dass die Scheibe während des gesamten Verfahrens gesund und unverzerrtbleibt. Andere Systeme können verwendet werden, um die Schnittphysiologie während der Aufnahme beizubehalten, aber die Scheibe sollte zu keinem Zeitpunkt verformt werden, da die Bildgebung jeden Teil d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT erhielt den JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 und JP15K00413) von MEXT und Zuschüssen des Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] und H30 [18062156]). Wir danken Editage (www.editage.jp) für die Englischsprachige Bearbeitung.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
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