Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi için yüksek çözünürlüklü elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu işleme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen mikrografikler, diğer hücresel bileşenlerin bir dizi morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için de kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağıtımının Ultrastrik morfometrik analizi için yenidoğan Rat beyin dokusunun hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Laboratuvarımız ve diğerleri sinaptik veziküller Morfoloji ve mekansal organizasyonu incelemek için iletim elektron mikroskobu yüksek çözme gücü sömürüyor. Ön sinaptik vezikül dağılımının nicel analizi için gerekli olan morfolojik ayrıntı derecesini verebileceğiniz yüksek kaliteli elektron mikrografileri elde etmek için optimum numune hazırlama önemlidir. Kimyasal sabitleme, numune hazırlama sürecinde ilk adımdır ve ince ultrastrasyon korumak için son derece önemlidir. Bir glutaraldehit-formaldehit çözeltisi ile vasküler fiktasyon, ardından osmiyum tetrokid ile vibratome-kesitli numunelerin tedavisinde, moleküllerin maksimum sayısını stabilize, özellikle protein ve lipidler, ve üstün koruma sonuçları . Doku daha sonra counterstaining, sıralı dehidrasyon ve reçine katıştırma ile işlenir. Uranyl asetat ile en blok boyama (yani, reçine gömme önce vibratome-kesitli doku boyama) endojen kontrast geliştirir ve numune işleme sırasında ekstraksiyon karşı hücre bileşenlerini stabilize. Ultra ince bölümlerinde bir post-leke olarak uranyl asetat uygulayarak kontrast daha da artırılabilir. Uranyl asetat tedavisi sonrasında kurşun sitrat ile ultra ince bölümlerin çift boyama da görüntü çözünürlüğü geliştirir, nüklik asit içeren yapıların elektron-opaklık yoğunlaştırarak uranyl asetat yol seçici bağlama yoluyla. İletim Elektron Mikroskopisi sinaptik veziküller morfolojik detayları ve Terminal Bouton kendi boyutu ve mekansal organizasyon Ölçüleme için güçlü bir araçtır. Ancak, sabit doku kullandığından, iletim elektron mikroskobu sadece yaşam veya gelişen süreçler ile ilgili dolaylı bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, ana amaç sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik veya işlevsel yönlerini incelemek için olduğunda diğer teknikler dikkate alınmalıdır.
Giriş
Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül uzamsal dağılımı derinlemesine morfometrik analizi için yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu hazırlanması için yöntemleri tarif1,2. Bu yöntemlerden sonra numuneler işlenerek elde edilebilir yüksek karşıtlık MİKROGRAFİ Ayrıca hücresel bileşenlerin bir dizi ayrıntılı Morfoloji ve boyutsal yapısal ilişkileri incelemek için kullanılabilir3,4.
İletim elektron mikroskobu (TEM) kantitatif organelleri ve diğer hücresel yapıların morfolojisi incele....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm çalışmalar, Virginia Üniversitesi 'nde (Charlottesville, VA) Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
1. vasküler perfüzyon ile fikrasyon
Not: Sıçan beyin vasküler perfüzyon yönteminin genel bir açıklaması bu Journal13 ' te zaten ayrıntılı olarak saptandı ve bu protokol kapsamı dışındadır. Ancak, aşağıdaki adımlar ön sinaptik terminallerde sinaptik veziküller dağılımının nicel analizi için yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu hazırlanma....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Özellikle TEM için numunenin tatmin edici veya arızalı Koruma göstergesi olarak kabul edilen genel kriterler kurulmuştur. Bu kriterler, bu protokolde açıklanan yöntemlerden sonra genç sıçan beyin dokusunu tedavi ederek elde edilen dört seçilmiş elektron mikrografında (optimum hazırlık iki örnek, kusurlu hazırlık iki örnek) örneklenmiştir.
Genel olarak, iyi kaliteli bir elektron MİKROGRAFİ düzenli, farklı ve genel grimsi görüntü olarak görünür. Tatmin edici hazırlanmış bir örnekten, membranlar .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
TEM için numune hazırlama sırasında doku bölümlerinin işlenmesi önemli ölçüde incelik, konsantrasyon ve sabır gerektirir. Çözümler eklemek ve kaldırmak için bir mikropipet kullanırken, numuneler yüzey gerilimi ile Pipet ucunu içine çekilebilir, bu nedenle pipet tarafından doku hasarından kaçınmak için büyük bir özen gösterilebilir. Ayrıca, dehidrasyon dizisinin belirli adımlar kadar hızlı olabilir 1 dakika, bu nedenle operatör hızlı bir sonraki dehidrasyon adım zamanında başlatıldı ve numune kuru veya kırışıklık sağlamak.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu yazıda NıH/NIGMS K08 123321 (N.L.) ve Virginia Üniversitesi Anesteziyoloji bölümü 'nden fon tarafından destekleniyordu. Yazarlar, TEM ile mükemmel eğitim ve teknik yardım ve onun paha biçilemez el yazması eleştirileri için alev erisir 'e (Biyoloji bölümü, Virginia Üniversitesi, Charlottesville, VA) teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca numune bölümleme ve sonrası boyama ile teknik yardım için Virginia Üniversitesi 'nde gelişmiş elektron mikroskopisi tesisi teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 4 Osmiyum tetroksit Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 19170 | sulu |
| %50 Gluteraldehit Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 16310 | EM sınıfı, sulu |
| Aclar 33 C gömme filmi | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 50425-25 | 7.8 mil kalınlık, boyut 8 "x10" |
| BEEM kapsül tutucu | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 69916 | tutar boyut "00" kapsül |
| BEEM gömme kapsüller Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 70021 | "boyut 00, düz (alt kesim)" |
| Butler blok düzeltici | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 69945-01 | |
| Deve kılı boya fırçası | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 65576-01 | |
| Disk zımbası | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 77850-09 | |
| Gömme 812 kiti | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 14120 | |
| Kurşun asetat Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 17600 | |
| Kurşun sitrat Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 17800 | |
| Kurşun nitrat Elektron | mikroskobu Bilimleri | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut mikrotom | Leica | ||
| Mikro ölçekli | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 62091-23 | |
| Paraformaldehit | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 19208 | EM sınıfı, granül |
| Hassas Thelco laboratuvar fırını | Thelco | 51221159 | |
| Sodyum azid | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark kalem | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 72109-01 | |
| Tiroz çözeltisi | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 11760-05 | |
| Uranil asetat | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 22400 | toz |
Kaynaklar
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
