אנו מתארים שיטה בפתרון כדי להחיל להטות אחיד כדי קולטני משטח טסיות באמצעות קונוס-צלחת ויסבנסה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם באופן כללי יותר כדי להחיל הטיה על סוגי תאים אחרים ושברי תאים, ואין צורך לייעד זוג מסוים של ליגולי-קולטן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים ביולוגיים רבים לחוש את התכונות המכאניות של הסביבה המקומית שלהם באמצעות מכנינים, חלבונים שיכולים להגיב לכוחות כמו לחץ או רטבאליות מכני. מכניקנים מזהים את הגירויים שלהם ומעבירים אותות באמצעות מגוון גדול של מנגנונים. חלק מן התפקידים השכיחים ביותר עבור מכניטורים הם בתגובות נוירואליות, כמו מגע וכאב, או תאי שיער הפועלים בשיווי משקל ושמיעה. המכונה גם חשובה עבור סוגי תאים אשר נחשפים באופן קבוע למתח הטיה כגון תאים אנדותל, אשר קו כלי דם, או תאי דם אשר חווים את ההטיה במחזור הרגיל. ויסברוטרס הם מכשירים המזהים את צמיגות הנוזלים. בנוסף, ניתן להשתמש בגומדי הסיבוב להחלת כוח הטיה ידוע על נוזלים. היכולת של מכשירים אלה כדי להחדיר הטיה אחיד לנוזלים נוצל ללמוד נוזלים ביולוגיים רבים, כולל דם פלזמה. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ויסבנסה להחלת הטיה על התאים בפתרון, ולבדיקת השפעות ההטיה בזוגות מסוימים של ליגטיים ולקולטן. כאן, אנו מנצלים חרוט-צלחת ומנסה לבחון את ההשפעות של רמות אנדודוגני של לחץ הטיה על טסיות שטופלו עם נוגדנים נגד טסיות הדם מכונאי קולטן המכונה GPIb-IX.
מבוא
מכניטורים הם חלבונים המגיבים לגירויים מכניים, כגון לחץ או עיוות מכני/דפורמציה. עבור חלק מהמכבשים, חישת הרטבאליות המכני הללו מפורשת לתפקוד סוגי התאים בהם הם מבוטאים. לקחת, למשל, קולטני למתוח ב baroreceptor נוירונים; אלה תעלות יון מכניתיים רגישות להסדיר לחץ דם על ידי חישת כלי דם "מתיחה"1,2. באוזן הפנימית, ערוצי יון על תאי השיער לזהות דפורמציות מכניות הנגרמת על ידי גלי קול3, ו מכני הסף נמוך המכונה מכונות (ltmrs) להקל על העברת מידע מישוש4. במקרים אחרים מספקים מכניקנים מידע חשוב לתא להקמת הדבקה או התפתחות. תאים יכולים לחוש קשיחות של הסביבה המקומית שלהם, והוא יכול להסת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות באמצעות טסיות האדם הנגזר התורם המתואר בזאת אושרו על ידי הלוח סקירה מוסדית של אוניברסיטת אמורי/הבריאות של הילדים של אטלנטה.
1. בידוד דם וטסיות
- לצייר דם אנושי מתוך ההסכמה תורמים מבוגרים בריאים באמצעות הניקוב ביום הניסוי לתוך 3.8% trisodium ציטראט. אחד 4.5 mL של דם הוא מספיק כדי להניב מספיק פלזמה עשיר טסיות (PRP) עבור 20-25 תנאים בתורמים אשר ספירות טסיות קרובים ל250 x 103 לכל μl.
הערה: הימנע מציור דם באמצעות מחטי מד צר (קטן מ -21 G). - הכן PRP באמצעות צנטריפוגה ב 22 ° צ' ו 140 x g עבור 12 דקות עם בלם ארוך. זה יגרום שתי שכבות נפרדות, עם כדוריות הדם האדומות בתחתית האור PRP בצבע בראש.
- ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מתאר כיצד מודל ההדק של הפעלת GPIb-IX, בתחילה הציג כדי להסביר הפעלת הקולטן התלוי הטיה כאשר מעוגן לקיר כלי, יכול גם לתמוך הפעלה של טסיות המקושרות על ידי ליגנטי רב. איור 2 מציג את הקריאות של הפעלת טסיות הדם האנושית שטופלו על ידי שני נוגדנים מיקוד התחום N-מסוף של GPIb-IX (6B4 ו-11A8), ונוגדן שליטה אחד (נורמלי igg) תחת תנאים סטטיים והוא. באיור 3, טסיות טופלו עם 6B4 ונוגדן עם כוח בלתי מחייב נמוך מדי כדי להפעיל את ההפעלה GPIb-IX, AK.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר הערכה מהירה ומגוונת של ההשפעה של הטיית למינאר על טסיות דם וקולטני משטח התא. תוצאות הנציג הספציפיות המוצגות כאן מדגישים כיצד ההשפעות של מולטימאריק או ביונטי ליגנדס יכולות להיות מושפעות מזרימת הטיה. בנוסף ליישום זה, שיטת גזירה אחידה כוללת יישומים רחבים בהתבוננות באפקטים התלויים בהטיה. בהעדר זוג מוכר של ליגולי-קולטן, מערכת ההטיה של מדים יכולה גם לזהות את ההשפעות של הטיה על גורמים כגון הצורה והאיתות של התאים, במיוחד כאשר הם משויכים לניתוחי זרימה. מרמזת בחלקו על-ידי איור .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
העבודה הרלוונטית למחקר זה נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות, ריאות ומכון הדם מענקים HL082808, HL123984 (ר), F31HL134241 (M.E.Q.). מימון שסופק גם על ידי NIH המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית גרנט T32GM008367 (M.E.Q.); והטייס מענק כספים משירותי הבריאות של הילדים של אטלנטה ואוניברסיטת אמורי הזרמת ילדים ליבה. המחברים רוצים להודות ד ר הנס מורן על שיתוף הנוגדן 6B4, ואת הילדים אמורי המרכז לחקר הילד זרימת Cy, ליבת ליבה לתמיכה טכנית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| APC אנטי אנושי CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield-FITC | ||
| מצומד Erythrina cristagalli לקטין (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer צינור איסוף דם כחול בהיר (נתרן ציטראט) | BD | 369714 | |
| Vacutainer, 21G x ¾ " מחט | BD | 367287 |
מקורות
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Sing....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
