यहाँ हम माउस मॉडल में रक्त monocytes की chemotactic गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, रक्त मोनोसाइट पर पोषण, औषधीय और आनुवंशिक हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने के लिए और रक्त monocytes व्युत्पन्न मैक्रोफेज की विशेषता के लिए एकासाइट-केमोएक्टेंट प्रोटीन-1 (एमसीपी-1) लोडेड बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग का उपयोग करने वाले माउस मॉडल।
ऊतक होमोस्टेसिस और मरम्मत एककोशिका व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती पर गंभीर रूप से निर्भर हैं। मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की कम और अधिक भर्ती दोनों घाव भरने को बाधित कर सकते हैं। हमने दिखाया है कि उच्च वसा और उच्च चीनी आहार monocyte प्राइमिंग और रोग को बढ़ावा देने, एक अति chemotactic phenotype में स्वस्थ रक्त monocytes परिवर्तित करने के लिए dysregulated सक्रियण प्रोफाइल और बिगड़ा phenotypic के साथ मैक्रोफेज में अंतर करने के लिए तैयार Plasticity. मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की अधिक भर्ती और डिस्विनियमित सक्रियण प्रोफाइल के साथ मैक्रोफेज की भर्ती चयापचय विकारों से जुड़े पुरानी सूजन रोगों के विकास में एक प्रमुख योगदानकर्ता माना जाता है, atherosclerosis और मोटापा सहित. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य monocyte प्राइमिंग और रोग के लिए एक biomarker के रूप में रक्त monocytes की chemotactic गतिविधि मात्रा निर्धारित करने के लिए और मैक्रोफेज phenotype रक्त monocytes की विशेषता के लिए इन माउस मॉडल में अंतर करने के लिए तैयार हैं. एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके, हम बताते हैं कि 24 एच 33% के बाद एमसीपी-1-लोडेड तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती किया गया है जो चूहों में इंजेक्ट किया जाता है मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज हैं; दिन 3 के बाद 58%. हालांकि, 5 दिन, मोनोसाइट और मैक्रोफेज संख्या में काफी कमी आई थी। अंत में, हम बताते हैं कि इस परख भी शल्य चिकित्सा से प्राप्त तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग, जो तब एकल सेल पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा बाद में विशेषता के अधीन किया जा सकता से रहते मैक्रोफेज के अलगाव के लिए अनुमति देता है.
मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती चयापचय विकारों से जुड़े पुराने भड़काऊ रोगों के विकास के लिए आवश्यक है, जिसमें एथेरोस्क्लेरोसिस और मोटापा1,2,3, 4. ऊतक चोट के स्थलों पर मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की संख्या के साथ-साथ उनकी प्लास्टिकता ऊतक होमोस्टेसिस और मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण हैं। मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की कम और अधिक भर्ती दोनों घाव भरने को बाधित कर सकते हैं5. स्थानीय ऊतक सूजन ट्रिगर, उदाहरण के लिए, कम घनत्व लिपोप्रोटीन के संचय और ऑक्सीकरण द्वारा (एलडीएल) महाधमनी दीवार में या फैटी एसिड या बैक्टीरिया lipopolysaccharide आंतों के माध्यम से लीक द्वारा adipocytes के भड़काऊ सक्रियण बाधा, इस तरह के मोनोसाइट chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1/ MCP-1 सी-सी रसायन परिवार का एक सदस्य है और ऊतक सूजन और चोट6,7,8, की साइटों के लिए मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख chemoattractant है, 9,10. संवहनी endothelium की भड़काऊ सक्रियण आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति में परिणाम इस तरह के intercellular आसंजन अणु के रूप में 1 (ICAM-1) और संवहनी सेल आसंजन अणु 1 (VCAM-1)11,12, अनुमति एमसीपी-1 द्वारा सक्रिय मोनोसाइट्स को साथ रोल करने के लिए, दृढ़ता से पालन करें और बाद में सबएंडोथेलियल अंतरिक्ष12में स्थानांतरित करें। मोनोसाइट्स में घुसपैठ मैक्रोफेज में अंतर करती है, जिसे एक प्रो इंफ्लेमेटरी फीनोटाइप में सक्रिय किया जा सकता है, जिससे तीव्र सूजन प्रक्रिया बढ़ जाती है। माइक्रोएनवायरनमेंट से प्रेरित, समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज सूजन को हल करने वाले मैक्रोफेज में परिवर्तित हो सकते हैं, जो सूजन कोशिकाओं के समाशोधन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, समर्थक भड़काऊ संकेतों को हटा सकते हैं और ऊतक की मरम्मत और घाव को पूरा कर सकते हैं उपचार12,13.
क्रोनिक चयापचय तनाव प्राइम्स मोनोसाइट्स के लिए नाटकीय रूप से बढ़ाया प्रतिक्रिया के लिए chemo-attractants और बढ़ी हुई monocyte भर्ती, और हमने दिखाया कि primed monocytes dyregulated सक्रियण कार्यक्रमों और ध्रुवीकरण के साथ मैक्रोफेज को जन्म देते हैं राज्यों14,15,16. Monocyte प्राइमिंग atherosclerosis को बढ़ावा देता है, मोटापा, और संभवतः अन्य पुरानी भड़काऊ ऐसे steatohepatitis के रूप में चयापचय विकारों के साथ जुड़े रोगों, गुर्दे की बीमारियों और संभवतः कैंसर. मानव रोगों के माउस मॉडल में मोनोसाइट प्राइमिंग का आकलन और परिमाणित करने के लिए, हमने विवो14,15,16में रसायन विज्ञान गतिविधि को मापने के द्वारा रक्त मोनोसाइट्स की प्राइमिंग स्थिति का आकलन करने के लिए एक नई तकनीक विकसित की , 17. हमारे दृष्टिकोण तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल या तो एक chemoattractant के साथ भरी हुई इंजेक्शन शामिल है – हम आमतौर पर MCP-1 का उपयोग करें – या वाहन में छोड़ दिया और सही पार्श्व में, क्रमशः, चूहों की. जब ध्यान से subcutaneously इंजेक्शन, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल एक एकल प्लग, जिसमें से chemokines फैलाना और एक परिभाषित chemotactic ढाल है कि आसपास के चयापचय या भड़काऊ राज्य से प्रभावित नहीं है बना सकते हैं फार्म का निर्माण होगा ऊतक या प्राप्तकर्ता माउस.
तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल हम अपने परख के लिए उपयोग एक solubilized तहखाने झिल्ली तैयार Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) माउस सार्कोमा, इस तरह के extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन में समृद्ध एक ट्यूमर से निकाला है. इस जटिल प्रोटीन मिश्रण में लेमिनिन (60%), कोलेजन IV (30%), ब्रिजिंग अणु एन्ैक्टिन (8%), और कई विकास कारक होते हैं। बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स प्लग परख को मूल रूप से विभिन्न विकास कारकों18,19के प्रत्युत्तर में एंजियोजेनेसिस की जांच करने के लिए विकसित किया गया था . हालांकि, मोनोसाइट कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए, एंडोथेलियल सेल भर्ती और एंजियोजेनेसिस को कम करने के लिए विकास कारक-विक्षत तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। क्या Matrigel बनाता है (के रूप में तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल अब से संदर्भित) अद्वितीय और विशेष रूप से उपयोगी है कि 10 डिग्री सेल्सियस से नीचे तापमान पर यह तरल पदार्थ, chemokines भंग करने के लिए अनुमति देता है. 22 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान तेजी से एक चरण संक्रमण से होकर गुजरती है और तेजी से एक हाइड्रोजेल बनाती है। प्लग शल्य चिकित्सा excised किया जा सकता है, साफ और एक बेसिलस व्युत्पन्न तटस्थ धातु loprotease के साथ भंग करने के लिए एकल सेल निलंबन उपज, जो एक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) पर विश्लेषण किया जा सकता है, आरएनएसेक द्वारा, एकल सेल आरएनए और अन्य की एक किस्म omics तकनीक. यहाँ हम तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग एक, इंजेक्शन के बाद तीन या पांच दिनों में भर्ती सेल आबादी की विशेषता के लिए एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के उपयोग का वर्णन.
हम एक में विवो chemotaxis परख विकसित की है, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न मैट्रिक्स और chemokines के साथ इस अद्वितीय मैट्रिक्स लोड और यह चूहों में इंजेक्ट करने की क्षमता के अद्वितीय भौतिक गुणों का उपयोग कर. परख हमें रहने वाले चूहों में मोनोसाइट्स की जवाबदेही का आकलन करने की अनुमति देता है (और मैक्रोफेज) chemokines के लिए, के रूप में MCP-1 के लिए यहाँ सचित्र, और या तो आनुवंशिक हेरफेर या औषधीय, आहार और monocyte पर अन्य पर्यावरण जोखिम के प्रभाव रसोटैक्सिस। क्योंकि chemokine ढाल हम इन चूहों में बनाने के अनिवार्य रूप से आनुवंशिक, औषधीय, आहार या पर्यावरण जोखिम से अप्रभावित है, monocyte chemotactic गतिविधि में परिवर्तन वास्तव में इन monocytes में कार्यात्मक परिवर्तन को प्रतिबिंबित और, जैसा कि हम दिखाया पहले भी दोनों प्रोटीन और प्रतिलेखन स्तर17,20पर reprogramming. हमने बताया कि चूहों में चयापचय तनाव chemoattractant के लिए monocyte प्रतिक्रिया बढ़ जाती है और यह कि इस अति-चेमोटेक्टिक गतिविधि वृद्धि हुई प्रोटीन एस-ग्लूटोथाइयोनिलन, एक प्रतिवर्ती, redox-निर्भर posttranslational के साथ संबंधित प्रोटीन संशोधन , जो ज्यादातर मामलों में एंजाइमी और प्रोटीन समारोह21,22की हानि की ओर जाता है , और कुछ मामलों में भी प्रोटीन गिरावट को बढ़ावा देताहै 16,23.
सफलतापूर्वक इस प्रक्रिया को निष्पादित करने के लिए और इस परख के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान की सटीक मात्रा धीरे धीरे एक विलक्षण अच्छी तरह से गठित प्लग बनाने के लिए इंजेक्शन हैं और रेशेदार कैप्सूल हटाया जाना चाहिए पूरी तरह से साफ प्लग पाने के लिए जब फसल तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग, dispase समाधान में पूरे प्लग के विघटन की सुविधा. हमारे डेटा बताते हैं कि तीन दिनों के लिए जानवरों में प्लग छोड़ने 1) संकेत तीव्रता का अनुकूलन, अर्थात्, प्रत्येक प्लग में भर्ती monocytes और मैक्रोफेज की संख्या, 2) संकेत की चयनात्मकता, अर्थात्, monocytes और मैक्रोफेज के भीतर कुल सेल आबादी और 3) संकेत की विशिष्टता, अर्थात वाहन की तुलना में MCP-1 के जवाब में monocytes और मैक्रोफेज में वृद्धि. अंत में, हम प्रदर्शित कैसे राज्य के-the-कला एकल सेल आधारित तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग परख के साथ संयोजन के रूप में दृष्टिकोण प्लग में भर्ती monocytes की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह के संभावित phenotype का एक स्नैपशॉट प्राप्त एककोशिका व्युत्पन्न मैक्रोफेज विशिष्ट आनुवंशिक, औषधीय, आहार या पर्यावरणीय हस्तक्षेप के जवाब में किसी भी माउस मॉडल में चोट के स्थलों के लिए भर्ती किया जा रहा है।
वहाँ परख की सीमाओं के एक नंबर रहे हैं पर विचार किया जाना है. सबसे पहले, माउस हैंडलिंग, संज्ञाहरण सहित, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान के इंजेक्शन, और शल्य विच्छेदन एकल प्लग और reproduible डेटा उत्पन्न करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता है. दूसरा, जबकि MCP-1 भरी हुई प्लग में भर्ती अधिकांश कोशिकाओं monocytes और मैक्रोफेज हैं, एक पर्याप्त संख्या नहीं हैं. यह अन्य की व्याख्या को प्रभावित कर सकता है, गैर एकल सेल आधारित विश्लेषणात्मक इस सेल आबादी पर प्रदर्शन पर परख. अंत में, के बाद से scWB के लिए सेल lysis शर्तों हल्के हैं, प्रोटीन के प्रवास दूरी मानक WB से अलग हो सकता है और प्रोटीन आकार के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकता है. इसलिए, दोनों सेल lysis और रन बार प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए मान्य किया जा करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए और प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया.
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को एनआईएच (AT006885) से आर.ए.
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |