Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Resumen

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Resumen

Los esferoides tridimensionales de las células cancerosas son herramientas importantes tanto para las pruebas de análisis de drogas contra el cáncer como para obtener información mecanicista sobre la biología de las células cancerosas. El poder de esta preparación radica en su capacidad para imitar muchos aspectos de las condiciones in vivo de los tumores, al mismo tiempo que es lo suficientemente rápido, barato y versátil como para permitir un cribado relativamente alto. Las condiciones del cultivo esferoide pueden recapitular los gradientes fisicoquímicos en un tumor, incluyendo la creciente acidez extracelular, aumento de lactato, y disminución de la disponibilidad de glucosa y oxígeno, desde la periferia esferoide hasta su núcleo. Además, las propiedades mecánicas y las interacciones célula-células de los tumores in vivo son en parte imitadas por este modelo. Las propiedades específicas y, en consecuencia, las condiciones óptimas de crecimiento, de los esferoides 3D, difieren ampliamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Además, la evaluación de la viabilidad celular y la muerte en esferoides 3D requiere métodos que difieran en parte de los empleados para cultivos 2D. Aquí describimos varios protocolos para la preparación de esferoides 3D de células cancerosas, y para el uso de estos cultivos para evaluar la viabilidad celular y la muerte en el contexto de la evaluación de la eficacia de los fármacos contra el cáncer.

Introducción

El uso de modelos de esferoides multicelulares en la biología del cáncer tiene varias décadas de edad^1,2, pero ha ganado un impulso sustancial en los últimos años. En gran parte, esto refleja una mayor conciencia de cuán fuerte depende el fenotipo de las células cancerosas de su microambiente y de las condiciones específicas de crecimiento. El microambiente en tumores sólidos es fundamentalmente diferente del de los tejidos normales correspondientes. Esto incluye condiciones fisicoquímicas como pH, tensión de oxígeno, así como presión intersticial, gradientes de concentración de factores solubles como nutrient....

Protocolo

1. Generación de esferoides

1. Preparación de suspensiones celulares para la formación de esferoides
   NOTA: Diferentes líneas celulares tienen propiedades de adhesión muy diferentes y se debe establecer el protocolo de formación de esferoides más adecuado en cada caso. Hemos encontrado que las células MCF-7 y BxPC-3 son adecuadas para la formación espontánea de esferoides, mientras que MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 y MiaPaCa requieren la adición de membrana de sótano reconstituida para formar con éxito esferoides. Solamente las células MDA-MB-231 y BxPC-3 se han empleado para el protocolo de caída colgante, sin embargo otras líneas celulares son....

Resultados

Ensayos de crecimiento esferoide basados en el protocolo de formación de esferoides esquemáticamente ilustrado en la Figura 1A y la Figura 1B, se utilizaron como punto de partida para el análisis de los efectos de los tratamientos farmacológicos contra el cáncer en un tumor 3D imitando el ajuste. La facilidad con la que se forman los esferoides es específica de la línea celular, y algunas líneas celulares requieren la suplementa.......

Discusión

El uso de esferoides de células cancerosas 3D ha demostrado ser una herramienta valiosa y versátil no sólo para la detección de fármacos contra el cáncer, sino también para obtener información mecanicista sobre la regulación de la muerte de las células cancerosas y la viabilidad en condiciones que imitan a los del tumor Microambiente. Esto es particularmente crucial ya que la accesibilidad, la aceptación celular y los efectos intracelulares de los medicamentos quimioterápicos se ven profundamente afectados por las condic.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-(4-amindiofenil)-1H-indol-6-carboxamidina (DAPI)	Invitrogen	# C10595	Para teñir núcleos
5-Fluorouracilo (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	Componente en el tratamiento quimioterapéutico
5-(N-etil-isopropil) amilorida (EIPA)	Life Technologies	#E3111	Inhibidor del anticuerpo NHE1
contra PARP y cPARP	Señalización celular	#9542	Utilizado en western blot
Anticuerpo contra Ki-67	Señalización celular	#9449	Utilizado para IHQ
Anticuerpo contra la señalización celular p53		#2524	Se utiliza para IHC
Anticuerpo contra β-actina	Sigma	A5441	Utilizado en Western blotting
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	Utilizado para la preparación de gel de agarosa
Escalera de proteínas de referencia	Invitrogen	#10747-012	Utilizado para SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit	Bio-Rad Laboratories	500-0113, #500-0114, #500-0115	Se utiliza para la determinación de proteínas a partir de lisados
Bü cámara rker	Marienfeld	610311	Para el recuento de células
Microscopio de eepifluoresión BX63	Olympus		Se utiliza para la obtención de imágenes fluorescentes
CellTiter-Glo 3D Cell Factability Assay	Promega	#G9681	Se utiliza para el ensayo de viabilidad celular
Cisplatino	Sigma-Aldrich	#P4394	Componente en el tratamiento quimioterapéutico
Microplaca esferoide Corning, 96 pocillos, negro con fondo redondo transparente,  Accesorio ultra bajo, con tapa, Cordón estéril		#4520	Se utiliza para el cultivo de esferoides con mediciones de luminiscencia como punto final
Pocillo Corning 96, fondo redondo transparente,  Microplaca de fijación ultrabaja, con tapa, Corning estéril		#7007	Suficiente para el crecimiento de esferoides sin mediciones de luminiscencia como punto final
Criterio TGX Geles prefabricados	Bio-Rad	5671025	utilizado para SDS-PAGE
Doxorrubicina	Abcam	#120629	componente en el tratamiento quimioterapéutico
FLUOStar Optima Lector de microplacas	BMG Labtech		Se utiliza para registrar luminiscencia
Formaldehído	Productos químicos de VWR	#9713.1000	Se utiliza para la fijación de células
Geltrex LDEV-Free Factor de Crecimiento Reducido Membrana Basal Matriz	Gibco	#A1413202	Mantener a 4 & grados; C para evitar la solidificación. Denominado rBM en el protocolo.
FBS	Sigma	#F9665	Suero inactivado por calor para medios de crecimiento
ImageJ	NIH		Scientific Análisis
de imágenes Casete Medim Uni-safe	Medim Histotechnologie	10-0114	Se utiliza para el almacenamiento de esferoides incrustados Mini tabletas de
cóctel inhibidor de proteasa	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	Se utiliza para la preparación del tampón de lisis
Microscopio MZ16	Leica		Se utiliza para imágenes microscópicas de luz
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer	Invitrogen	#NP0007	Utilizado para Western blot
Pierce ECL Western blot	substrate Thermo scientific	#32106	Utilizado para Western blot
Ponceau S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	Utilizado para la tinción de bandas de proteínas
Prism 6.0	Graphpad		Scientific Software gráfico y estadístico
Yoduro de propidio (solución de 1 mg/ml en agua)	Invitrogen	P3566	Sensible a la luz
Reservorios estériles, multicanal	SPL lifesciences	21002	Utilizado para la siembra de células para la formación de esferoides
Superfrost Ultra-Plus Corredera de adhesión	Menzel-Glä ser	#J3800AMNZ	Portaobjetos de vidrio para microscopio utilizado para la inclusión de
Tamoxifeno	Sigma-Aldrich	#T5648	Utilizado como tratamiento quimioterapéutico
Trans-blot Turbo 0.2 µ m membranas de nitrocelulosa	Bio-Rad	#170-4159	Utilizado para el Western blot
Tris/Glycine/SDS running buffer	Bio-Rad	#161 0732	Utilizado para la solución SDS-PAGE
Trypsin-EDTA	Sigma	#T4174	Enzima de disociación celular

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