אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster
במאמר זה
סיכום
תקציר
יש הרבה מה להבין על התחלתה והתקדמות של מחלות ניווניות, כולל הגנים הבסיסיים האחראים. הקרנה גנטית קדימה באמצעות מוטגנים כימיים היא אסטרטגיה שימושית עבור מיפוי פנוטיפים מוטנטים לגנים בקרב דרוזופילה ואורגניזמים אחרים של מודל החולקים מסלולים סלולריים שמרו עם בני אדם. אם גן העניין המוטציה אינו קטלני בשלבים התפתחותיים מוקדמים של זבובים, ניתן לנהל שיטת טיפוס על המסך עבור אינדיקטורים פנופי של תפקוד מוחי מופחת, כגון שיעורי טיפוס נמוכים. לאחר מכן, ניתוח היסטולוגית משנית של רקמת המוח ניתן לבצע על מנת לאמת את תפקוד נוירוגני של הגן על ידי הבקיע פנוטיפים נוירוניוון. אסטרטגיות מיפוי גנטי כוללות meiotic ומיפוי מחסור המסתמכים על אותו בחני שיכול להיות ואחריו ברצף DNA כדי לזהות שינויים של נוקלאוטיד אפשרי בגנים של עניין.
מבוא
נוירונים הם עבור החלק ביותר post-mitotic ולא מסוגל לחילוק1,2. ברוב החיות, מנגנוני הגנה מפני המוח קיימים כדי לשמור על תאים אלה במהלך תוחלת החיים של האורגניזם, במיוחד בגיל הזקנה כאשר הנוירונים פגיעים ביותר לנזק. גנים המשמשים את המנגנונים האלה ניתן לזהות במוטציות המציגות ניוון, מחוון גמישות פנוטיפית לאובדן הגנה עצבית, באמצעות פרוטוקול גנטי קדמי. המסכים הגנטיים הקדמיים באמצעות מוטגנים כימיים כגון אתיל מתיונין (EMS) או N-אתיל-N-ניטרוגליצרין (אנו) שימושיים במיוחד בשל מוטציות בנקודה אקראית שהם לגרום, וכתוצאה מכך גישה משוחדת מטבעו כי יש לשפוך אור על מספר רב של פונקציות גנים באורגניזמים המודל איקריוטית
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה והזדקנות זבובים
- השג או צור6 אוסף של מוטציות דרוזופילה שישמשו עבור המסך הגנטי. כאן, הקווים אנו-מוטזזזד ממופה הכרומוזום השני ומאוזנת על Cyo משמשים.
- ההגביר את קווי הגנוטיפ הניסיוניים בחממה שנקבעה ב -25 ° c, 12 h מחזור אור/כהה על מדיום קמח-מולסה.
- לאסוף סביב 20 homozygous צאצאים בין 0-2 ימים של eclosion מבוגר מכל גנוטיפ ניסיוני. למנוע הטיית מין על ידי איסוף עקבי של גברים או נשים זבובים.
- בגיל הזבובים על מדיום קמח-מולסה כנדרש ב -29 ° c, היפוך הבקבוקונים כל 2-3 ימים על מנת לשמור על הזבובים על מזון טרי כפי שהם מזדקנים. במסך שהוצגו כאן, הגיעו לכאן זבובים ב10-12 ימים.
- הכנס תא בדיק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ב aerticle זה, אנו מציגים את הצעדים המשמשים כדי לזהות את הגידול המוח גנטי (פרחח) כמו לשחק תפקיד תחזוקה של שלמות עצבית (למשל, הגנה מפני העצבים) ב למבוגרים זבובים17; מתודולוגיה שיכולה לשמש לזיהוי גנים המעורבים בהגנה עצבית. השתמשנו בגישה גנטית מקדימה (האסטרטגיה מחולקת באיור 1A) כדי לדפדף באוסף של זבובים מוטניים כימיים באמצעות שיטת טיפוס (המנגנון המשמש לטיפול זה מוצג באיור 1a). בין 235 homoz.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המסכים הגנטיים הקדמיים בדרוזוהילה מהווה גישה אפקטיבית לזיהוי גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הגנה מפני גיל5,23,24, 25. באמצעות אסטרטגיה זו, היינו מצליחים לזהות פרחח כמו גן נוירוגני הרומן17.
צעד קריטי אחד בפרוטוקול זה כרוך באוריינטציה הנכונה של ראשים (כפי שמתואר בסעיף 4.4.3.) לניתוח היסטולוגיה. בנוסף, סמנים של הקו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
תודות
אנחנו אסירי תודה במיוחד לד ר בארי גאנצקי, במעבדה של מי המסך הגנטי בוצע, המאפשר זיהוי ואפיון של פרחח כמו גן נוירוגני. אנו מודים לד ר סטיבן רובינוב באדיבות לספק את האוסף של הזבובים של אנו-מוטייזד המשמשים במסך הגנטי המוצג במאמר זה. אנו מודים לחברי מעבדת גנצקי, ד"ר גרייס בוהוף-פלק ודוד ווסטמן לדיונים מועילים במהלך הפרויקט, לינג לינג הו ובוב קרבר לסיוע טכני, ד ר אקי אישידה לשימוש במתקן המיקרוטום שלו ב אוניברסיטת ויסקונסין וד ר קים לאקי והמכון לאנליזה אופטית באוניברסיטת אלבמה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO;
משטח דגם אמבט תוכנת R חבילת תוכנה
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ציוד עיקרי | |||
| מכסה אדים להיסטולוגיה | |||
| מיקרוסקופ אור | Nikon | Eclipe E100 | המטרה המועדפת להדמיה היא תוכנת הדמיה 20x |
| מצלמת מיקרוסקופ | ניקון | ||
| ציקלר תרמי | אפנדורף | ||
| <חזק>זבוב דוחף ומטפס מבחן | |||
| VWR® בקבוקון דרוזופילה, | צר VWR | 75813-160 | |
| VWR® קלטת תיוג מעבדה לשימוש כללי | VWR | 89097-912 | |
| עכבר סטנדרטי | |||
| סטריאוסקופ | מוטי | SMZ-168 | |
| CO2 תחנת הרדמה (Blowgun, שסתום רגל, Flypad האולטימטיבי) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | לא tinclude מיכל CO2 |
| מברשות קצה עדין | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118Bloomington | Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | קו Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila המשמש למיפוי רקומבינציה | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | קו איזון דרוזופילה המשמש למיפוי רקומבינציה |
| ערכת מחסור לכרומוזום 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| ניתוח היסטולוגיה | |||
| אתנול, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | תרמו פישר סיינטיפיק | C298-500 | |
| חומצה אצטית קרחונית | תרמו פישר סיינטיפיק | A38-500 | |
| Fisherbrand™ צינורות מיקרוצנטריפוגה פרימיום: 1.5 מ"ל | תרמו פישר סיינטיפיק | 05-408-129 | |
| סוכן סליקה Histochoice 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ ריצ'רד-אלן מדעי ומסחרי; הרכבה | בינונית תרמו מדעית ומסחרית; 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost שקופיות מיקרוסקופ פולי-L-ליזין, 75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ משקפי כיסוי: מלבנים | פישרברנד | 12-545M | מידות: 24 מ"מ x 60 מ"מ |
| טיימר ניתן למעקב | VWR | ||
| מחמם שקופיות | Barnstead International | דגם מס' 26025 | |
| מגש שקופיות ומתלים | DWK Life Sciences | Rack להכיל 20 שקופיות | |
| Fisherbrand™ מלקחיים ארוכים במיוחד לשימוש כללי | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | קימברלי-קלארק וסחר; מקצועי | ||
| אפליקטורים פוריטניים בגודל 6 אינץ' | חברת מוצרי עץ קשה, גילפורד, מיין | 807-12 | |
| VWR® סכיני גילוח | VWR | 55411-050 | |
| טאפרוור או מיכלי זכוכית לנוזלים היסטולוגיים | 16 + 1 למים זורמים | ||
| להבי מיקרוטום מצופים בפרופיל גבוה | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ דלי קרח עגול עם מכסה, 4 ליטר | Corning ™ | ||
| או מיכל אחר למי קרח וקלטות | |||
| רקמות | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| ניתוח מולקולרי | |||
| Wizard® מערכת ניקוי SV ג'ל ו-PCR | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA פולימראז | TaKaRa | 5 U/μ l | |
| Invitrogen ומסחר; SYBR וסחר; סחר בטוח; כתם ג'ל DNA | Invitrogen ומסחר; | ||
| UltraPure&Trade; אגרוז | Invitrogen ומסחר; | ||
| סולם DNA 1 Kb פלוס | Invitrogen ומסחר; | ||
| עורך פלסמיד ApE-A | זמינה להורדה בחינם | ||
| ניתוח סטטיסטי | |||
| ניתוח נוסף | |||
| Dr[1]/TM3, Sb[1] | מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה | 59967 |
מקורות
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
