En ny prøve holder for makro molekylære X-ray crystallography sammen med en passende håndtering protokollen er presentert. Systemet tillater krystallvekst, krystall soaking og in situ Diffraksjon datainnsamling på begge, ambient og kryogene temperatur uten behov for noen krystall manipulasjon eller montering.
Makro molekylære X-ray crystallography (MX) er den mest fremtredende metoden for å oppnå høyoppløselig tredimensjonal kunnskap om biologiske makromolekyler. En forutsetning for metoden er at svært bestilte krystallinsk prøven må dyrkes fra Makromolekyl å bli studert, som deretter må være forberedt på Diffraksjon eksperimentet. Denne forberedelsen prosedyren innebærer vanligvis fjerning av krystall fra løsningen, der den ble dyrket, soaking av krystall i ligand løsning eller protectant løsning og deretter immobilizing krystallen på en montering som passer for eksperimentet. Et alvorlig problem for denne prosedyren er at makro molekylære krystaller er ofte mekanisk ustabil og ganske skjør. Følgelig kan håndteringen av slike skjøre krystaller lett bli en flaskehals i en struktur besluttsomhet forsøk. Enhver mekanisk kraft påføres slike delikate krystaller kan forstyrre den vanlige pakking av molekylene og kan føre til tap av Diffraksjon kraft av krystaller. Her presenterer vi en roman alt-i-ett prøve holderen, som er utviklet for å minimere håndteringen av krystaller og dermed å maksimere suksessen rate av strukturen besluttsomhet eksperimentet. Eksempel holde ren støtter oppsettet av krystall dråper ved å bytte ut de brukte deksel sedlene. Videre tillater det på stedet krystall manipulasjon som ligand soaking, fryse-beskyttelse og kompleks dannelse uten åpning av krystallisering hulrom og uten krystall håndtering. Til slutt er prøve holderen utformet for å muliggjøre innsamling av Diffraksjon-data i både Omgivelses-og kryogene temperatur. Ved å bruke denne prøve holderen, er sjansene for å skade krystallen på vei fra krystallisering til Diffraksjon datainnsamling betraktelig redusert siden direkte krystall håndtering ikke lenger er nødvendig.
Kunnskapen om den tredimensjonale strukturen av biologiske makromolekyler utgjør en viktig hjørnestein i alle grunnleggende biologiske, biokjemiske og biomedisinsk forskning. Dette strekker seg til og med visse translational aspekter ved slik forskning, som for eksempel legemiddel funn. Blant alle metoder for å skaffe slike tredimensjonale opplysninger på Atomic oppløsning X-ray crystallography er den mektigste og mest fremtredende en som er dokumentert av det faktum at 90% av all tilgjengelig strukturell informasjon er bidratt med X-ray crystallography1. Den viktigste forutsetningen for røntgen crystallography, som samtidig er dens store begrensning, er at Diffraksjon-krystaller må produseres og forberedes for Diffraksjon eksperimentet. Dette trinnet utgjør fortsatt en av de store flaskehalser i metoden.
Historisk ble Diffraksjon data fra protein krystaller samlet inn ved omgivelsestemperatur. Individuelle krystaller ble omhyggelig overført til glass eller kvarts blodkar før datainnsamlingen, mor brennevin ble tilsatt til blodkar slik at krystallene ikke ville tørke ut og blodkar ble beseglet2,3, firetil. Siden 1980-tallet, ble det mer og mer tydelig at på grunn av ioniserende egenskaper av X-stråling og den forestående stråling følsomheten av makro molekylære krystaller, datainnsamling ved omgivelsestemperatur utgjør alvorlige begrensninger på metoden. Følgelig ble det utviklet tilnærminger for å dempe strålings skadevirkninger ved å kjøle makro molekylære krystaller ned til 100 K og samle Diffraksjon data ved slike lav temperatur5,6. For arbeid ved lave temperaturer, ble monteringen av prøvene i blodkar upraktisk på grunn av den lave hastigheten på varmeoverføringen. Til tross for dette, er det pågående arbeidet med å også bruke blodkar, spesielt fra mot diffusjon krystallisering eksperimenter, for lav temperatur Diffraksjon arbeid7,8, men, uavhengig av det, ble det standard tilnærming i makro molekylære crystallography å montere makro molekylære krystaller holdt av en tynn film av mors brennevin inne i en tynn kablet loop9,10. Selv om en rekke forbedringer (f. eks innføringen av litografiske løkker og lignende strukturer11) har blitt gjort over tid til denne loop-baserte montering, de grunnleggende prinsippene som ble utviklet i begynnelsen av 1990-tallet er fortsatt i bruk i dag. Det kan være trygt uttalt at de fleste Diffraksjon data samlinger på makro molekylære krystaller i dag fortsatt stole på denne tilnærmingen5.
Over tid var det noen interessante nye utbygginger og modifikasjoner av loop-baserte montering metoden, men disse tilnærmingene har så langt ikke vært allment vedtatt i samfunnet. En er den såkalte loop-mindre montering av krystaller, som ble utviklet for å oppnå lavere bakgrunn spredning12,13,14. En annen en er bruken av grafen hylser å vikle krystallinsk prøvene og for å beskytte dem fra å tørke ut. Grafen er et godt egnet materiale i den forbindelse på grunn av sin svært lave røntgen spredning bakgrunn15.
I nyere tid var utviklingen innen prøve monteringer hovedsakelig fokusert på å standardisering festene med sikte på å øke prøve gjennomstrømningen16 eller på å designe mounts, som kan inneholde mer enn ett utvalg17, som for eksempel mønstrede membraner på en silisium ramme, som er i stand til å holde hundrevis av små krystaller hovedsakelig innen seriell crystallography18, 19,20,21,22.
Alle prøven monteringsmetoder diskutert så langt fortsatt krever en viss grad av manuell intervensjon, noe som betyr at det er en iboende fare for å forårsake mekaniske skader på prøven. Derfor er romanen tilnærminger søkes av engineering prøven miljøet slik at Diffraksjon data av krystaller kan samles inn i deres vekst miljø. En slik metode er betegnet in situ eller plate-screening23,24 og det er allerede implementert på en rekke makro molekylære crystallography beamlines på ulike Synchrotron kilder over hele verden25. Imidlertid er bruken av denne metoden begrenset av de geometriske parametrene av krystall platen og plassen som er tilgjengelig rundt prøvepunktet på instrumentet.
Enda en tilnærming er realisert i den såkalte CrystalDirect system26. Her høstes hele krystallisering dråper automatisk. Folier som krystallene er dyrket på, er spesiallaget ved hjelp av en laser og brukes direkte som prøve holderen27.
I arbeidet som er beskrevet her, var målet å utvikle en prøve holderen, som ville tillate en bruker å flytte krystallinsk prøven fra vekst kammeret til datainnsamlingen enheten uten å berøre den og som ville gjøre det mulig for brukeren å manipulere prøven lett. Siden mange forskere innen makro molekylære crystallography er fortsatt bruker 24-brønn krystallisering format for å optimalisere krystallvekst ved å endre forholdene identifisert i store screening kampanjer, ble den nye prøven holderen designet for å være kompatibelt med dette formatet. I det følgende beskrives utformingen av den nye prøve holderen, og håndteringen og ytelsen til prøve holderen for in situ-datainnsamling og ligand soaking vil bli demonstrert. Til slutt vil egnetheten til denne nye prøve holderen samt dens begrensninger for de ulike arbeidstrinnene bli diskutert.
Egnethet for krystallisering eksperimenter. Den nye prøven holdere kan brukes til standard hengende drop krystallisering eksperimenter ved hjelp av enten 24-brønn Linbro type plater (typer 1 og 2), eller 24-godt SBS fotavtrykk plater der hver brønn har en diameter på 18 mm (type 3). De kan brukes i stedet for standard mikroskop cover slips. Amorfe COC-folie sørger for luft tetthets av systemet. Overvåkingen av krystallisering eksperimentet er mulig ved hjelp av en overføring lys mikroskop, på grunn av bruk av høy klarhet folier. Til det beste av vår kunnskap, ingen andre utvalg holdere finnes for 24-brønn krystallisering plater, som ville tillate krystall manipulasjon eller Diffraksjon eksperimenter, uten mekanisk fjerne krystallen fra drop, der det er dyrket. Dette er av særlig betydning, siden mange forskere i feltet fortsatt stole på slike plater for krystall optimalisering, på grunn av det faktum at større drop volumer kan brukes i forhold til 96-velsittende-drop plater. Med disse større drop volumer, kan større krystaller fås.
Egnet for krystall manipulasjon. På grunn av de selvhelbredende egenskapene til den ytre COC-folien og den mikroporøse strukturen til den indre gule Polyimide folien, er krystall miljøet tilgjengelig og krystallene kan manipuleres uten mekanisk overføring til andre beholdere. Dette gjør prøven holdere veldig praktisk. Det eneste andre systemet vi vet om, som gjør dette indirekte og skånsom tilgang til krystallen, er CrystalDirect systemet26. Men CrystalDirect er mindre fleksibel siden spesielle 96-brønn krystallisering plater må brukes. Folien, som krystallene vokser, er det samme som forsegler krystallisering eksperimentet, og det er ikke selvhelbredende. Dette betyr at en blenderåpning som har blitt boret inn i folien med laser ablasjon for ligand eller protectant levering til krystallene, vil forbli åpen, og øke sjansen for flytende fordampning. Dette er i kontrast til vår design, hvor krystaller ikke vil bli direkte eksponert for miljøet selv om COC folie blir gjennomboret en rekke ganger.
Egnethet for in situ Diffraksjon eksperimenter ved omgivelsestemperatur. Prøven holderen kan fjernes fra krystallisering plate i en rett fram måte, fast på en magnetisk base og satt på en beamline goniometer. For en Diffraksjon eksperiment ved romtemperatur, er det tilrådelig å sette prøven inn i en luftstrøm av definert fuktighet33. Moren brennevin rundt krystallen kan fjernes før du setter prøven holderen på goniometer for å redusere bakgrunnen spredning. Et slikt oppsett er stabilt i timevis.
Egnethet av brukt materiale for drift og lagring på 100 K. Verken materialet som brukes til fremstilling av prøve holderen eller den Polyimide filmen påvirkes negativt ved å kjøle dem ned til lave temperaturer34. Derfor er det ikke et alvorlig problem å arbeide med prøve holderen ved lav temperatur (f.eks. 100 K).
Egnethet for in situ Diffraksjon eksperimenter på 100 K. For datainnsamling på 100 K i en nitrogen stream, må prøve holderen fjernes fra krystallisering plate som i forrige avsnitt, stakk på en magnetisk base og satt i en gass nitrogen strøm ved 100 K på en beamline goniometer. Hvis ønskelig, kan prøven også være fryse-beskyttet, selv om det er sannsynlig at for nakne prøver kan dette ikke være nødvendig i de fleste tilfeller31. For eksperimenter på 100 K, er prøve innehaverne type 2 og 3 bedre egnet fordi den ytre plastringen kan fjernes. Derfor er de av mindre størrelse og bør derfor være mindre utsatt for glasur. Men selv en prøve innehaver av type 1 kan brukes. Gitt en ikke altfor høy luftfuktighet i den eksperimentelle bur og en riktig justert fryse systemet glasur opp av holderen er egentlig ikke et problem.
Begrensningene. Eksempel holde ren geometri tillater uhindret Diffraksjon datainnsamling ved rotasjonsmetoden over et totalt rotasjons område på 160 °. Dette er tilstrekkelig slik at komplett Diffraksjon datasett kan fås for de fleste krystall systemer. I tilfeller der dette ikke er mulig, må data fra mer enn krystall flettes sammen. Når krystaller dyrkes sammen, kan det være mulig å justere størrelsen på hendelsen X-ray strålen slik at bare deler av individuelle krystaller er eksponert. I ekstreme tilfeller kan man trenge å ty til en datainnsamlings strategi som ligner på MeshAndCollect tilnærming35. Oppsummert, mens det er visse begrensninger knyttet til utvalget holdere, disse kan overvinnes i de fleste tilfeller. Selvfølgelig er det alltid mulig at situasjoner er oppstått, der ingenting av dette er mulig. I slike tilfeller kan man trenge å ty til andre krystall monteringsmetoder.
Vi har beskrevet en roman type sample holder for makro molekylære crystallography og vi har vist egnetheten av prøven holdere for ulike bruksområder. Tatt i betraktning den enkle og reproduserbar håndtering av protein krystaller, samt de unike egenskapene til prøven holdere, tror vi at disse utvalgene holdere vil vise seg å være et verdifullt tillegg til arsenal av prøven holdere for makro molekylære crystallography.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke BESSY II, drevet av Helmholtz-Zentrum Berlin for stråle tid tilgang og støtte, og avdelingene for eksempel miljø og teknisk design for deres hjelp med design og konstruksjon og tilgang til 3D-Printer fasiliteter.
AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |