通过乙基甲烷硫素突变在小谷物作物中靶向诱导局部病变(TILLING)种群的发展
Summary
描述是使用乙基甲酸酯 (EMS) 作为诱变剂在小谷物作物中开发靶向诱导局部病变(TILLING)人群的协议。还提供了使用Cel-1测定突变检测的协议。
Abstract
靶向诱导局部病变在基因组(TILLING)是一个强大的反向遗传学工具,包括化学诱变和检测靶基因的序列变异。TILLING 是一种非常有价值的功能基因组学工具,用于基因验证,特别是在基于转化的方法存在严重局限性的小颗粒中。培养一个强大的诱变种群是确定基于TILLING的基因验证研究的效率的关键。总体突变频率较低的一个蒂林种群表明,必须筛选数量庞大的人群以找到所需的突变,而高诱变浓度会导致种群死亡率高,导致数量不足诱变个体的数量。一旦形成有效种群,有多种方法来检测感兴趣的基因突变,平台的选择取决于实验规模和资源的可用性。Cel-1测定法和基于甘蔗的凝胶基方法用于突变物鉴定,方便、可重复,且平台资源密集度较低。它具有优势,因为它简单,不需要计算知识,并且特别适用于使用基本实验室设备验证少量基因。本文介绍了良好的蒂林种群的发育方法,包括制备剂量曲线、突变种群的诱变和维持,以及使用基于PCR的Cel-1测定对突变种群进行筛查.
Introduction
基因组中的点突变可以为研究人员提供许多有用的用途。根据它们的性质和位置,这些突变可用于将功能分配给基因,甚至不同感兴趣的蛋白质域。另一方面,作为新基因变异的来源,可以使用表型屏筛选来选择有用的突变,并进一步用于作物改良。TILLING是一个强大的反向遗传学工具,包括化学诱变和检测靶基因中的序列变异。最早在阿拉伯拟南芥1和果蝇黑色素2中开发,TILLING种群已被开发和用于许多小谷物作物,如六倍体面包小麦(三叶草)3,大麦 (Ordeum 庸)4, 四倍体杜鲁姆小麦 (T. 三氯球菌杜鲁姆)5,双发化小麦 (T.单球体)6和”D” 基因组后代小麦Aegilops tauschii7.这些资源已被用来验证基因在调节非生物和生物应激性8,调节开花时间9,并开发营养优越的作物品种5的作用。
除使用烷基化诱变诱变剂(如乙酸甲酸酯(EMS)、阿齐德钠、N-甲基-N-硝酸钠(MNU)和甲基甲酸甲酸酯(MMS)外,其优越性优于其他反向遗传学工具,原因有若干原因。首先,诱变可以在几乎任何物种或植物10品种上进行,并且独立于转化瓶颈,在小谷物11的情况下尤其具有挑战性。其次,除了产生其他基因验证方法可以获得的敲除突变外,还可以诱导一系列误感和拼接突变,从而可以分辨感兴趣的蛋白质的单个域的功能。此外,TILLING生成整个基因组中不朽的突变集合;因此,单个种群可用于多个基因的功能验证。相反,其他反向遗传学工具只生成研究13下的基因特有的资源。通过TILLING识别的有用突变可以用于育种目的,不受调控,不像基因编辑,其非转基因分类在许多国家仍然不确定。这变得特别相关的小谷物,是国际贸易14。
TILLING是一种简单而有效的基因验证策略,需要开发诱变种群以研究感兴趣的基因。发展有效的诱变种群是确定基于TILLING的基因验证研究效率的关键。总体突变频率较低的一个蒂林种群表明,必须对不切实际的大种群进行所需的突变筛查,而高诱变浓度会导致种群死亡率高,且数量不足。诱变个体。一旦形成良好的种群,有多种方法来检测感兴趣的基因突变,平台的选择取决于实验规模和资源的可用性。全基因组测序和外兆体测序已被用来描述具有小基因组15、16的植物中蒂林种群的所有突变。两个TILLING种群的外泄序列测序已在面包和杜鲁姆小麦中进行,供公众识别理想的突变和订购突变的感兴趣线17。就理想突变的可用性而言,它是一个伟大的公共资源;然而,在基因验证研究中,野生型线应具有感兴趣的候选基因。不幸的是,对整个TILLING种群的外在体进行测序,以便在另一个背景下对几个候选基因进行反向遗传学验证,仍然是成本高昂的。Amplicon测序和基于Cel-1的检测已用于检测小麦靶向种群的突变,Cel-1测定更简单,无需计算知识,特别适用于验证少数具有基本基因的基因实验室设备6,18 。
在本文中,介绍了发展良好蒂林种群的方法,包括制备剂量曲线、突变种群的诱变和维持,以及使用基于PCR的Cel-1测定对突变种群进行筛查.该协议已经成功地实施,开发和利用三聚体、三聚体6、大麦、Aegilops tauchii和几个别人。其中包括这些方法的明确细节,以及有用的提示,这将有助于研究人员发展TILLING种群,使用EMS作为诱变任何小谷物植物的选择。
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING是一种非常有价值的反向遗传学工具,用于基因验证,特别是对于基于转化的方法存在严重瓶颈的小颗粒。培养高突变频率的诱变种群是进行功能基因组学研究的关键步骤之一。发展强健的TILLING种群的最重要步骤是确定EMS的最佳浓度。M1中40%-60%的存活率是小麦和大麦4、6、18EMS诱变效果的良好指标。</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国农业部国家粮食和农业研究所、Hatch项目1016879和马里兰州农业实验站通过MAES授权号2956952的支持。
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
