Utvikling av målretting indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) populasjoner i små korn avlinger av etanol Methanesulfonate mutagenese
Summary
Beskrevet er en protokoll for utvikling av en målgruppe indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) befolkning i små korn avlinger med bruk av etanol methanesulfonate (EMS) som en arvestoffskadelig. Også gitt er en protokoll for mutasjon deteksjon ved hjelp av cel-1-analysen.
Abstract
Målretting indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) er et kraftig omvendt genetikk verktøy som inkluderer kjemiske mutagenese og deteksjon av sekvens variasjon i mål gener. TILLING er et svært verdifullt funksjonelt Genomics verktøy for gen validering, spesielt i små korn der transformasjon-baserte tilnærminger holder alvorlige begrensninger. Å utvikle en robust mutagenized befolkning er nøkkelen til å bestemme effektiviteten av en TILLING-basert gen validerings studie. En TILLING befolkning med en lav samlet mutasjon frekvens indikerer at en uhensiktsmessig stor befolkning må undersøkes for å finne ønskede mutasjoner, mens en høy arvestoffskadelig konsentrasjon fører til høy dødelighet i befolkningen, noe som fører til en utilstrekkelig antall mutagenized individer. Når en effektiv befolkning er utviklet, er det flere måter å oppdage mutasjoner i et gen av interesse, og valg av plattform avhenger av eksperimentell skala og tilgjengelighet av ressurser. Cel-1-analysen og agarose gel-basert tilnærming for mutant identifisering er praktisk, reproduserbar og en mindre ressurs intensiv plattform. Det er en fordel i at det er enkelt, krever ingen beregningsorientert kunnskap, og det er spesielt egnet for validering av et lite antall gener med grunnleggende laboratorieutstyr. I denne artikkelen er beskrevet metodene for utvikling av en god TILLING befolkning, inkludert utarbeidelse av dosering kurve, mutagenese og vedlikehold av mutant befolkningen, og screening av mutant befolkningen ved hjelp av PCR-baserte cel-1 analysen .
Introduction
Point mutasjoner i genomer kan tjene mange nyttige formål for forskere. Avhengig av deres natur og plassering, kan disse mutasjoner brukes til å tildele funksjoner til gener eller til og med forskjellige domener av proteiner av interesse. På den annen side, som en kilde til romanen genetisk variasjon, kan nyttige mutasjoner velges for ønskede egenskaper ved hjelp av bestemmelse av fenotype skjermer og videre brukt i avling forbedring. TILLING er et kraftig omvendt genetikk verktøy som inkluderer kjemisk mutagenese og deteksjon av sekvens variasjon i målet genet. Først utviklet i Arabidopsis1 og Drosophilia melanogaster2, TILLING populasjoner har blitt utviklet og benyttet i mange små korn avlinger som hexaploid brød hvete (Triticum aestivum)3, Bygg (Hordeum vulgare)4, Tetraploid durum hvete (t. dicoccoides durum)5, diploid hvete (t. monococcum)6 og “D” Genova stamfar av hvete Aegilops tauschii7 . Disse ressursene har blitt brukt til å validere rollene til gener i regulering abiotiske og biotiske stress toleranse8, regulere blomstrende tid9, og utvikle ernæringsmessig overlegen avling varianter5.
TILLING, sammen med bruk av alkylating mutagent agenter som etanol methanesulfonate (EMS), natrium Natriumazid, N-metyl-N-nitrosourea (MNU), og methyl methanesulfonate (MMS), har fordeler fremfor andre omvendt genetikk verktøy av flere grunner. Først, mutagenese kan gjennomføres på praktisk talt alle arter eller variasjon av anlegget10 og er uavhengig av transformasjon flaskehalsen, som er spesielt utfordrende i tilfelle av små korn11. For det andre, i tillegg til å generere knockout mutasjoner som kan fås ved andre gen validering tilnærminger, en rekke missense og skjøting mutasjoner kan bli indusert, som kan skjelne funksjoner av individuelle domener av proteiner av interesse12. Videre genererer TILLING en udødelig samling av mutasjoner i hele Genova; Dermed kan en enkelt befolkning brukes til funksjonell validering av flere gener. I motsetning til dette genererer andre omvendt genetikk verktøy ressurser som er spesifikke for bare genet under studie13. Nyttige mutasjoner identifisert gjennom TILLING kan distribueres til avl formål og er ikke underlagt regulering, i motsetning til genredigering, hvis ikke-transgene klassifisering er fortsatt usikkert i mange land. Dette blir spesielt relevant for små korn som er internasjonalt omsatt14.
TILLING er en enkel og effektiv gen validerings strategi og krever at mutagenized populasjoner utvikles for å undersøke gener av interesse. Å utvikle en effektiv mutagenized befolkning er nøkkelen til å bestemme effektiviteten av en TILLING-basert gen validerings studie. En TILLING befolkning med en lav samlet mutasjon frekvens indikerer at en uhensiktsmessig stor befolkning må undersøkes for ønskede mutasjoner, mens en høy arvestoffskadelig konsentrasjon fører til høy dødelighet i befolkningen og et utilstrekkelig antall mutagenized individer. Når en god befolkning er utviklet, er det flere måter å oppdage mutasjoner i genene av interesse, og valg av plattform avhenger av eksperimentell skala og tilgjengelighet av ressurser. Hele Genova sekvensering og exome sekvensering har blitt brukt til å karakterisere alle mutasjoner i TILLING populasjoner i planter med små genomer15,16. Exome sekvensering av to TILLING populasjoner har blitt utført i brød og durum hvete og er tilgjengelig for allmennheten for å identifisere ønskelig mutasjoner og bestilling mutant linjer av interesse17. Det er en stor offentlig ressurs i form av tilgjengelighet av ønskelige mutasjoner; i gen valideringsstudier bør imidlertid den ville-type-linjen ha kandidat genet av interesse. Beklageligvis, det er en fremdeles bekostning-uoverkommelige å orden exome av det hel TILLING befolkning for det omvendte genetikk-basert godkjenningen av et par kandidaten gener inne en annen miljøet. Amplicon sekvensering og cel-1-baserte analyser har vært brukt i å oppdage mutasjoner i målrettede populasjoner i hvete, og cel-1 analysene er enklere, krever ingen beregningsorientert kunnskap, og er spesielt egnet for validering av et lite antall gener med grunnleggende laboratorieutstyr6,18.
I denne artikkelen er beskrevet metoder for utvikling av en god TILLING befolkning, inkludert utarbeidelse av dosering kurve, mutagenese og vedlikehold av mutant befolkningen, og screening av mutant befolkningen ved hjelp av PCR-baserte cel-1 analysen . Denne protokollen har allerede blitt implementert med suksess i å utvikle og utnytte mutagenized bestander av Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, bygg, Aegilops tauchii7, og flere Andre. Inkludert er eksplisitte detaljer om disse metodene sammen med nyttige tips som vil hjelpe forskere utvikle TILLING populasjoner, ved hjelp av EMS som en arvestoffskadelig i noen små korn anlegg av valget.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING er et svært verdifullt omvendt genetikk verktøy for gen validering, spesielt for små korn der transformasjon-baserte tilnærminger har alvorlige flaskehalser11. Utvikling av en mutagenized befolkning med høy mutasjon frekvens er en av de kritiske skritt i å gjennomføre funksjonelle Genomics studier. Det viktigste steget i utviklingen av en robust TILLING befolkning er å bestemme den optimale konsentrasjonen av EMS. Den 40%-60% overlevelse i M1 er funnet å være en god in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjekt 1016879 og Maryland Agricultural Experiment Station via MAES Grant no. 2956952.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
- Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
- Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
- Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
- Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
- Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).
- Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
- Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
- Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
- Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
- Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
- Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
- Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).
- Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
- Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
- Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
- Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).
- Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
- Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
- Wu, J. -. L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
- Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
- Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
- Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
- Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).
