Summary
Beskrivs här är ett protokoll för direkt immunolabelling av nekrotiska myofibers i muskel kryosektioner. Nekrotiska celler är permeabla för serumproteiner, inklusive immunglobulin G (IgG). Avslöjar upptaget av IgG av myofibers möjliggör identifiering och kvantifiering av myofibers som genomgår nekros oavsett muskel tillstånd.
Abstract
Den nekros av muskelfibrer (myonecrosis) spelar en central roll i patogenesen av flera muskelsjukdomar, inklusive muskeldystrophies. Terapeutiska alternativ som behandlar orsakerna till muskeldystrofi patogenes förväntas lindra muskel degeneration. Därför behövs en metod för att analys och kvantifiera omfattningen av celldöd i Muskelbiopsier. Konventionella metoder för att observera myofiber degeneration in situ är antingen dåligt kvantitativa eller förlita sig på injektion av vitala färgämnen. I denna artikel, en immunofluorescensprotokoll beskrivs som fläckar nekrotiska myofibers genom att rikta immunglobulin G (IgG) upptag av myofibers. IgG upptagnings metoden baseras på Cellegenskaper som kännetecknar nekrotisk död, inklusive 1) förlusten av plasmamembran integritet med frisättning av skadeassocierade molekylära mönster och 2) upptag av plasmatiska proteiner. I murina tvärsnitt, Co-immunolabelling av myofibers, extracellulära matrix proteiner, och mus IgG tillåter ren och enkel identifiering av myofibers med nekrotisk öde. Denna enkla metod lämpar sig för kvantitativ analys och gäller för alla arter, inklusive mänskliga prover, och kräver inte injektion av vitala färgämnen. Färgning av nekrotiska myofibers av IgG upptag kan också paras ihop med andra samtidig immunolabelling.
Introduction
Tvärstrimmig skelettmuskulaturen består huvudsakligen av muskelfibrer (myofibers), som är ansvariga för den karakteristiska frivilliga kontraktila funktion. Dessa celler är multinucleated, post-mitotiska strukturer som stöder mekanisk stress inträffar under kontraktion. Strukturell stabilitet av myofiber membranet (sarcolemma) och dess extracellulära matris är avgörande för vävnad homeostas. Satellit celler utgör den viktigaste muskeln stamfader i mogna skelett muskler och finns i en quiescent tillstånd i friska muskler. Efter myofiber död, muskel förnyelse stöds av satellit celler efter en Myogenic program som involverar satellit cell aktivering, proliferation, differentiering, och fusion att slutligen bilda nya flerkärniga myofibers.
Myofiber nedläggningen kan förekomma i flera muskel förhållanden, inklusive mekaniska trauma, ischemia-reperfusion skador, eller muskeldystrophies, och det är förknippat med den nekrotiska morfologin av döda celler1,2. Nekrotisk död kännetecknas av den snabba permeabiliteten i plasmamembranet och frisättning av cellinnehåll i extracellulära facket3. Det kan bero på antingen en oreglerad process som inte innebär någon ordentlig cellsignalering (dvs. oavsiktlig nekros), eller en orkeslerad intracellulär väg (dvs., reglerad nekros). I myofibers, både reglerade4 och oreglerade5 processer kan leda till nekros. En typisk följd av myonecrosis är frisläppandet av skadeassocierade molekyl mönster, aktivera ett kraftfullt inflammatoriskt svar6. Närvaron av makrofager observeras vid cirka 48 h och 72 h efter skada7. Förutom sin roll i clearance av nekrotisk skräp, de är också viktiga i muskel förnyelse8,9.
Muskeldystrofier (MDs) är en heterogen grupp av patologier som ofta beror på en defekt i sarcolemma struktur. Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en juvenil X-länkade sjukdom som drabbar cirka 1 av varje 3 500 manliga födslar över hela världen10, och det orsakas av frånvaron av dystrofin uttryck vid sarcolemma. Kronisk degeneration av muskelvävnad i DMD pojkar leder till extrem muskelsvaghet och tidig dödlighet. Inflammation till följd av nekrotisk död ökar cytotoxicitet, och främjar muskel fibros och förlusten av muskelfunktion11,12. Behandlingar som för närvarande i kliniska prövningar som riktar sig till rötterna av muskel degenerativa sjukdomar, såsom genterapi, förväntas lindra myonecrosis. Enkla tekniker för att exakt kvantifiera muskel degeneration behövs därför.
Flera metoder används rutinmässigt för att övervaka myofiber förlust in vivo. Mätningen av den enzymatiska aktiviteten av kreatinkinas (CK) i blodet möjliggör tillförlitlig kvantifiering av pågående nekros i muskel-och hjärtvävnad. In situ, den hematoxylin och eosin (H & E) färgning är den mest populära metoden som för närvarande används i diagnosen för att bedöma degeneration-Regeneration Remodelling. Den molekylära grunden för H & E-märkningen av döda celler är dock fortfarande oklar. Dessutom, färgändringar tyder myofiber död i H & E färgning är relativt subtila och inte underlättar tillförlitlig och reproducerbar kvantifiering. Metoder som avslöjar DNA-fragmentering, såsom terminalen deoxynucleotidyltransferas dUTP Nick end märkning (TUNEL), ofullständigt etikett nekrotisk död3. De är också dåligt anpassade för att övervaka död syncytial celler såsom myofibers. Injektionen av vitala färgämnen, såsom Evan ' s Blue Dye (EBD), representerar ett användbart alternativ för att bedöma myofibers som har förlorat integriteten av sarcolemma, men är inte nödvändigtvis bekvämt i vissa experimentella protokoll. Till exempel kan närvaron av EBD i blodprov påverka resultaten av CK-mätningar, en kolorimetrisk analys. Dessutom gör intracellulärt upptag av EBD Co-immunolabelling utmanande. Därför är en alternativ metod som möjliggör direkt märkning av myofibers som genomgår nekros av intresse.
Verkningsmekanismen av vitala färgämnen förlitar sig på förlusten av plasmamembranet integritet i nekrotiska myofibers och passiv upptag av det injicerade färgämnet. Likaså, nekrotiska myofibers upptag blodproteiner såsom albumin, för vilka EBD har en stark affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), och IgM15. Den onormala närvaron av blodproteiner inom myofibers representerar därför bekväma markörer för myonecrosis in situ. Färgning dessa proteiner kan vara ett alternativ för användning av vitala färgämnen.
Genom att använda IgG upptag som markör för myonecrosis in situ, detta protokoll används för att bedöma muskel degeneration i tibialis anterior (TA) av MDX Dystrophin-bristfällig möss. Denna metod ger betydande fördelar jämfört med alternativa tekniker: 1) den är reproducerbar och enkel i utförandet; 2) det kräver inte någon djur behandling före muskel uppsamling, såsom injektion av cirkulerande vitala färgämnen, och 3) som en konventionell immunolabelling, det är förenligt med co-märkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment utfördes i enlighet med den franska och Europeiska gemenskapens lagstiftning (licensnummer 11-00010).
1. tragacanth tuggummi beredning
- Lös 6 g dragant pulver i en glasbägare i 100 ml avjoniserat vatten. Täck med folie och låt verka i minst 3 h. ibland rör om manuellt med en metallspatel som blandningen snabbt blir trögflytande.
- Lämna dragant blandningen vid 60 ° c över natten i ett vattenbad eller i ugnen. Försegla bägaren noggrant för att undvika uttorkning. Rör om minst en gång före Ali citering.
- Alikvot och förvara vid 4 ° c i upp till 2 veckor.
2. muskel samling
Anmärkning: för detta experiment, en 4-veckors gammal manlig MDX mus offrades av livmoderhalscancer dislokation. Detta förfarande kräver inte anestesi och är en human avlivningsmetod i enlighet med lokal lagstiftning.
- Dissektion av den främre tibialis-muskeln (TA)
- Efter rakning musen benet, låg musen på ryggen och stift fötterna på en kork skiva med nålar. Med precision sax (eller en skalpell) och pincett, ta bort benet huden från foten upp till knäet för att exponera hela längden på Tibia och TA.
- Med sax, göra ett snitt mellan skenbenet och TA. Detta kommer att underlätta separation av TA från benet och ge ett enkelt grepp till epimysium. Med hjälp av precisions tång, ta försiktigt bort epimysium skiktet från ytan av TA.
Anmärkning: från detta steg, TA kan vara mer mottagliga för torkning, som bör undvikas. - Vid vristregionen, isolera TA senan från andra senor med pinps. Dra försiktigt upp TA-senan för att isolera den från skenbenet och omgivande muskler.
- När TA magen är helt åtskilda, håll senan upp så att endast den proximala delen av TA-muskeln är ansluten till knäet. Försiktigt bryta den proximala senan så nära som möjligt till knä benet.
- Placera TA i en gasväv som lätt dämpas med saltlösning för att undvika torkning innan du fryser muskeln.
- Pre-cool 70 − 100 ml isopentan i en plast eller polytetrafluoreten bägare genom att delvis doppa den i flytande kväve. Låt den svalna tills isopentan längst ner på bägaren blir en vit solid.
- På en cirkulär bit kork (20 mm x 11 mm x 8 mm), placera ~ 0,5 ml av dragant tuggummi. Noggrant pre-Label den andra sidan av korken så att biopsin kan identifieras korrekt efter frysning steg.
- Bädda in TA i tuggummi med tång, distala senor upp. För att möjliggöra lämpliga tvärsnitt av muskeln, hålla muskeln med sin axel vinkelrätt mot korken ytan. Kvaliteten på kryosektionerna kommer att förbättras om biopsi inte är helt inbäddade i tandköttet. Låt minst hälften av TA (senan sida) som skall avtäckt av tandköttet.
- Snabbt doppa korken med inbäddade muskler i ofrysta, kallt isopentan skikt. Observera att korken kommer att flyta i vätskan isopentane. Håll provet upp och ner eftersom muskeln behöver doppas i isopentane. Lämna proverna i isopentan för ca 2 min för att möjliggöra fullständig frysning.
Anmärkning: från detta skede måste TA förbli fryst tills cryosection. Förvara muskeln i torris före långtidsförvaring i a-80 ° c frys.
3. kryosnittning
- Ställ in kryostattemperaturen vid-25 ° c. Håll objekt temperaturen på runt-20 ° c. Fixera objektet i kryostaten med optimal skärtemperatur (OCT) förening. Trimma muskeln tills når muskeln magen sedan skära 7 − 10 μm sektioner.
Observera: stabiliseringen av objekt temperaturen kräver minst 10 min. - Förvara glas bilder som används för uppsamling av kryosektioner i rumstemperatur (RT). Samla in minst två sektioner på varje bild. Muskeln sektionerna kommer automatiskt att sticka och Tina vid kontakt med den varma glas rutschbana. Ta bort bilden och behåll den på RT.
- Låt sektionerna torka minst 20 min vid RT i en ventilerad miljö.
- Förvara kryosektionerna på glas rutschbanor vid-80 ° c fram till användning.
4. immunolabelling
- Tina glider på RT i minst 15 minuter i en ventilerad miljö.
- Avgränsa sektion området med en hydrofoba penna. Låt hydrofoba barriären torka.
- Fixera vävnaden med 2% PARAFORMALDEHYD i 10 minuter i en fuktig kammare.
- Tvätta sektionerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 2x för 5 min vardera.
- Blockera muskel sektioner med 10% get serum utspädd i PBS för 1 h vid RT i en fuktig kammare.
- Inkubera sektionerna för 2 h vid RT (eller över natten vid 4 ° c) i en fuktig kammare med de primära antikropparna utspädda i 5% get serum. För enkel IgG upptaget märkning i myofibers, endast Inkubera sektioner med kanin antikropp till mus Pan-laminin.
Anmärkning: andra antigener av den extracellulära matrisen kan riktas så länge de ger tydlig märkning av den omgivande extracellulära matrisen av myofibers. Markörer för muskel förnyelse, inflammation, eller andra parametrar kan kombineras så länge som antikropparna inte höjs i en mus värd. Mikroskopet som används för analysen bör innehålla en kompletterande fluorescensfärg. - Tvätta sektionerna med PBS 3x för 5 min vardera.
- Inkubera sektionerna med röd fluorescerande get polyklonala sekundär antikropp till kanin IgG H & L och grön fluorescerande get polyklonala sekundär antikropp till mus IgG H & L. Inkubera vid RT för 45 min i en fuktig kammare.
- Tvätta med PBS 3x för 10 min vardera.
- Montera sektionerna i fluorescerande monteringsmedium som innehåller 100 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och täck varje bild med en täckglas.
- Låt torka över natten vid 4 ° c före avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myofibers är omgivna av en laminin-innehållande extracellulär matris. Rödfärgning avgränsar myofibers periferi och gör det möjligt för deras identifiering. IgG visas i grönt. Kärnor färgas med DAPI och finns blå under mikroskopet. Kärnor visas dock i vitt här (figur 1). En svag IgG immunoreaktivitet förväntas i det extracellulära facket, som kan ökas i händelse av inflammation. Grönfärgning inom myofibers återspeglar närvaron av IgG.
MDX mus TAs kännetecknas av en övergående fas av akut myonekros vid 3 veckors ålder, följt av asynkrona degeneration-förnyelse händelser. Därför visar TAs från 4 veckor gamla MDX-möss ofta heterogena profiler, inklusive dåligt drabbade områden, och degenererade och regenererande områden tillsammans i samma tvärsnitt (figur 1a). Opåverkade/milt drabbade muskel områden innehåller myofibers med stor och homogen storlek, och kärnor finns på en låg densitet och är främst belägna i periferin eller mellan myofibers (figur 1b). IgG-positiva myofibers är i allmänhet frånvarande i sådana friska eller milt drabbade områden.
IgG-immunoreaktivitet inom myofibers indikerar myonecrosis (figur 1c, nedre delen). Efter cell degeneration rensas nekrotiska fibrer ut av fagocyter. Nybildade myofibers presentera liten storlek i ett tidigt skede, och sedan successivt förstora som muskel progenitorer säkring och bidra till syncytial cellen. Under denna process är myonuklei kvar på det centrala läget. Kluster av små, centralt nukleerade myofibers indikerar nyligen regenererande myofibers (figur 1c, övre delen).
Figur 1: representativ bild av IgG-upptagningsfärgning i ett tvärsnitt från degenerering av MDX-muskler. (a) ta från en 4-veckors gammal MDX-mus var kryosektionerad och immunolabel med antikroppar mot Pan-laminin upp i kanin (röd) och mus IgG (grön). Kärnor var märkta med DAPI (vit). (b, c) Förstorade områden av panel a. Scale bar = 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myofiber nekros är en vanlig följd av traumatisk övning i normala muskler. Den är väl kompenserad av en kraftfull regenerativ kapacitet hos de lokala muskel progenitorerna. Emellertid, i flera muskel tillstånd som i MDs, regenerativ kapacitet av satellit celler äventyras av kronisk myonecrosis och överdriven fibros. De senaste rönen visar att muskelfibrer kan dö genom nekroptos, en reglerad form av nekros. Mer specifikt kan hämning av necroptos bli en ny terapeutisk strategi för DMD behandling4. Undersöka celldöd vägar i muskel degeneration störningar kräver tillförlitliga metoder för muskel cell död kvantifiering. Detta protokoll beskriver IgG upptaget immunofluorescensteknik som etiketter myofibers som genomgick nekros.
Förlusten av plasmamembran integritet som kännetecknar nekros leder till frisättning av skador-associerade molekyler mönster och upptag av plasmatiska proteiner såsom albumin, IgG och IgM15. Verkningsmekanismen för metoden för användning av IgG-upptag liknar den hos vitala färgämnen som EBD. Nekrotiska myofibers blir genomsläpplig och fälla blodproteiner av injicerade vitala färgämnen, medan levande celler inte. Proof-of-konceptet av denna teknik har validerats av Kevin Campbell grupp på MDs15 men är inte tillräckligt spridas.
Figur 1 ger typiska resultat av användning av IgG-märkning i dystrofiska muskler som påverkas av myonekros. Med en immunolabelling inklusive endast tre färger (IgG i grönt, extracellulär matris i rött och kärnor i blått/vitt). Flera viktiga parametrar i muskeln histologi kan kvantifieras, inklusive antalet och storleken på myofibers och omfattningen av myonecrosis, uttryckt antingen av andelen märkning i tvärsnittsarea eller procent av nekrotiska myofibers. En rättvis uppskattning av regenereringen kan också bestämmas med denna färgning. Faktum är att närvaron av centralt nukleerade myofibers (figur 1c, övre delen) återspeglar lokal förnyelse och därmed förbi den degenererade händelsen. För jämförelse, frisk muskelvävnad presenteras i figur 1b. Notera, Central kärnbildning i nybildade myofibers varar i flera veckor i regenererad myofibers av vuxna möss. Emellertid, nukleär ompositionering sker betydligt snabbare före avvänjning ålder i möss16.
Denna typ av resultat kan lätt berikas genom att lägga till en annan märkning avslöjas av en annan färg. Till exempel kan arten och fenotypen hos de infiltrerande cellerna undersökas ytterligare med hjälp av lämpliga markörer. Antikroppar riktade mot CD68 kommer företrädesvis etikett makrofagpopulationer, oavsett deras inflammatoriska status4,9. Vid behov kan den inflammatoriska statusen hos dessa celler undersökas ytterligare17.
Som alla konventionella fluorescerande färgning, är kvaliteten på muskeln avgörande. Muskelbiopsier och kryosektioner bör hållas i torris hela tiden och för långtidsförvaring vid-80 ° c fram till användning. Förvaring vid-20 ° c bör undvikas eftersom det kan påverka vävnads konservering. Frys-upptinning cykler av prover bör också strikt undvikas.
Denna teknik har betydande fördelar jämfört med de mest populära teknikerna, såsom EBD och H & E fläckar. Det är enkelt och flexibelt och kräver endast konventionellt immunolabellningsmaterial och fluorescerande Mikroskop. Flexibilitet erbjuds när det gäller valet av fluorophore färg i samband med IgG enligt experimentella behov, samt när det gäller prestanda av samtidig immunolabelling mot ytterligare antigener. Som en jämförelse, H & E fläck och EBD kan bara avslöjas i samma färg och kan inte associeras med annan märkning för att bedöma viktiga parametrar såsom myofiber plats eller omfattningen och arten av inflammatoriska celler infiltrera. EBD-metoden kräver färg injektion av djur runt 24 timmar innan musklerna skördas, medan IgG-upptagnings metoden kan utföras i alla prover, inklusive människor. Hela muskulaturen hos EBD-injicerade djur innehåller det färgämne som möjligen kan påverka ytterligare analys såsom fluorescerande immunolabelling av muskler eller blod CK kolorimetrisk analys.
Bestämning av exakt kvantifiering av myonekros innebär företrädesvis en tillförlitlig markör för celltyp. Här kan cellernas natur bedömas tillsammans med nekrotiskt öde genom att co-märka IgG med det extracellulära facket kring myofibers. I figur 1, myofibers identifierades med antikroppar riktade mot proteiner i den omgivande extracellulära matrisen såsom laminin. Andra komponenter såsom kollagen kan också färgas. Antikroppar mot proteiner som tillhör sarcolemma bör dock undvikas. Enligt vår erfarenhet försvinner deras immunoreaktivitet snabbt efter nekros av fibrerna.
Immunolabellning av IgG upptag inom myofibers är en enkel och tillförlitlig metod för att specifikt fläta nekrotiska muskelfibrer. Den kan enkelt och rutinmässigt utföras och är tillämplig på prover som är mottagliga för klassisk immunofluorescensinfärgning. Med tanke på dess specificitet och allmän brist på motindikationer, det rekommenderas att använda som en guld standard för myonecrosis bedömning, oavsett arten av den nekrotiska skadan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av föreningen française contre Les Myopathies med Translamuscle programmet. Författarna tackar Dr Perla Reyes-Fernandez och Dr Matthew Borok för deras noggranna läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
