종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징
Summary
이 프로토콜은 이중 생물 발광 이미징에 의해 종양 진행 및 혈관신생을 실시간으로 모니터링하는 종양 베어링 마우스 모델의 확립을 설명합니다.
Abstract
혈관 신생은 종양 진행의 중요한 과정으로서 항 종양 치료의 연구 핫스팟및 표적이되었습니다. 그러나, 종양 진행 및 혈관 신생을 동시에 시각적이고 민감한 방식으로 추적하기위한 신뢰할 수있는 모델은 없다. 생물 발광 이미징은 높은 감도, 강한 특이성 및 정확한 측정의 장점으로 인해 살아있는 이미징에서 고유 한 우수성을 보여줍니다. 여기서 제시된 프로토콜은 혈관신생 유도반딧불 루시퍼라아제 발현을 가진 형질전환 마우스내로 르니야 루시퍼라아제 표지 된 뮤린 유방암 세포주 4T1을 주입함으로써 종양-베어링 마우스 모델을 확립하는 프로토콜이다. 이 마우스 모델은 단일 마우스에서 이중 생물 발광 이미징을 통해 종양 진행 및 혈관 신생을 실시간으로 동시에 모니터링하는 귀중한 도구를 제공합니다. 이 모델은 항종양 약물 스크리닝 및 종양학 연구에 널리 적용될 수 있다.
Introduction
혈관 신생은 작고 국소 된 신 생물에서 더 크고 잠재적으로 전이성 종양으로암의진행에 필수적인 과정입니다 1,2. 종양 성장과 혈관 신생 사이의 상관 관계는 종양학 연구 분야에서 강조되는 점 중 하나가됩니다. 그러나, 형태학적 변화를 측정하는 전통적인 방법은 가시화 된 접근을 사용하여 살아있는 동물에서 동시에 종양 진행 및 혈관 신생을 모니터링하지 못합니다.
종양 세포의 생물 발광 이미징 (BLI)은 비 침습성, 민감성 및 특이성 3,4,5, 6 때문에 종양 성장을 모니터링하는 특히 적절한 실험 방법입니다. . BLI 기술은 루시퍼라제가 생물 발광을 방출하면서 특정 기판의 산화를 촉매할 수 있다는 원리를 기반으로 합니다. 이식된 종양 세포에서 발현되는 루시퍼라제는 생체 영상 시스템에 의해 검출될 수 있는 주입된 기질과 반응하고, 신호는 생체내 세포 수 또는 세포 국소화의 변화를 간접적으로 반영한다 6,7.
종양 성장을 제외하고, 종양 혈관신생(암 진행에 중요한 단계)은 또한 Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스8,9,10을사용하여 BLI 기술을 통해 가시화될 수 있다. 혈관 내피 성장 인자(Vegf) 수용체 2(Vegfr2), Vegf 수용체의 한 유형은, 주로 성인 마우스(11)의혈관 내피 세포에서 발현된다. Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스에서, 반딧불 루시퍼라제(Fluc)의 DNA 서열은 내인성 Vegfr2 서열의 첫 번째 엑소로 노크된다. 그 결과, Fluc은 마우스에서 혈관신생 의 수준과 동일한 방식으로 (BLI 신호로 나타나는) 발현된다. 크기가 몇 밀리미터 를 넘어 성장하기 위해 종양은 종양 세포에서 성장 인자에 의해 유발 된 Vegfr2를매우 발현하는 기존 혈관에서 새로운 혈관을 모집합니다 1. 이것은 BLI에 의한 비침습적으로 종양 혈관신생을 모니터링하기 위해 Vegfr2-Fluc-KI 형질전환 마우스를 사용할 가능성을 열어준다.
본 프로토콜에서, 종양 베어링 마우스 모델은 반딧불 루시퍼라제(Fluc) 및 레닐라루시퍼라제(Rluc) 이미징을 통해 단일 마우스에서종양 진행 및 혈관신생을 모니터링하기 위해 각각 확립된다(도 1). 4T1 세포주(4T1-RR)는 Rluc 이미징에 의해 세포 성장을 추적하기 위해 Rluc 및 적색 형광 단백질(RFP)을 안정적으로 발현하는 것으로 생성됩니다. 종양의 진행 및 회귀에서 혈관신생의 동적 변화를 추가로 조사하기 위해, 또 다른 4T1 세포주(4T1-RRT)는 자살 유전자 포진 심플렉스 바이러스를 발현하여 티미딘 키나아제(HSV-ttk), Rluc 및 RFP를 발현하는 것으로 생성된다. 간시클로비르(GCV)의 투여에 의해, HSV-ttk 발현 세포는 선택적으로 절제된다. 이러한 세포주를 기반으로, Vegfr2-Fluc-KI 마우스의 종양 베어링 모델은 생체 내에서 종양 진행 및 종양 혈관신생을 연결하는 실험 모델역할을 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 비침습적 이중 BLI 접근법은 종양 발달 및 혈관신생을 모니터링하기 위해 기술된다. BLI 리포터 시스템은 Rluc 이미징에 의해 생체 내 종양 진행 및 회귀를 추적하기 위한 HSV-ttk/GCV 자살 유전자를 포함하는 처음 개발되었습니다. 한편, 종양 혈관신생은 Fluc 이미징을 통해 Vegfr2-Fluc-KI 마우스를 사용하여 평가된다. 이 종양 베어링 마우스 모델은 높은 관련성, 재현성 및 번역성을 가진 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFA0103200), 중국 국립자연과학재단(81671734), 천진과학기술지원사업(18YFZCS000010), 기초연구기금의 지원을 받았습니다. 중앙 대학 (63191155). 우리는 원고의 품질을 향상시키는 데 중요한 글로리아 낸스의 개정을 인정합니다.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
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