DiI による心灌流を用いた Teleost 脳および下垂体の血管の標識

Summary

本稿は、DiI の心臓灌流を固定で希釈し、メダカ (Oryzias latipes) をモデルとして使用し、脳と下垂体組織に焦点を当てて、teleost 魚の血管を標識するための迅速なプロトコールについて説明する。

Abstract

血管は、脊椎動物のすべての組織を innervate し、必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供することによって生存を可能にします。それは開発の間に機能し始める最初の器官の1つである。血管形成のメカニズムは、高い科学的、臨床的関心の対象となっています。.しかし、成人では、他の組織の深部への局在のために、ほとんどの生物動物の血管系を可視化することは困難である。それにもかかわらず、内分泌学や神経生物などのいくつかの研究において、血管の可視化は依然として重要である。ゼブラフィッシュにはいくつかの遺伝子導入ラインが開発されていますが、蛍光タンパク質の発現によって血管が直接視覚化されるため、他の teleost 種にはそのようなツールは存在しません。モデルとしてメダカ (Oryzias latipes) を使用して、現在のプロトコルは、DiI を含む固定液と心臓を介して等量によって脳と下垂体の血管を標識するための迅速かつ直接的な技術を提示します。このプロトコルは、脳と下垂体細胞が全体の組織または厚い組織スライスにおける血液脈管系と相互作用する方法についての我々の理解を改善することができます.

Introduction

血管は、すべての臓器に必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供するため、脊椎動物の身体に不可欠な役割を果たします。また、がん開発に関与していることが発見されて以来、臨床研究において注目を集めています。多くの刊行物が血管の成長と形態形成を可能にするメカニズムを調査しており、その形成に重要な多数の遺伝子が同定されているが、その相互作用に関しては多くの理解が残っている細胞または組織と循環血液との間。

脳と下垂体の血液血管系の可視化が重要です。.脳内のニューロンは、酸素とグルコース³の高い供給を必要とし、下垂体は、脳からの信号を受信し、異なるにそれぞれのホルモンを送信する血流を使用して8つの重要なホルモン産生細胞の種類が含まれています末梢器官^4,5.哺乳動物において、その中央値と称される視床下部の基部にある門脈システムは、脳と下垂体⁶とを結んでおり、このような明確な血中ブリッジは teleost 魚には記載されていない。実際には、魚類では、preoptico 視床下部ニューロンは直接下垂体⁷のパルスに軸索を投影し、主に異なる内分泌....

Protocol

すべての動物の取り扱いは、ノルウェー生命科学大学の研究動物のケアと福祉のための勧告に従って行われ、認定研究者の監督下にありました。

1. 機器とソリューションの準備

1. 1 mL の 96% Etoh 中で 1.5 mL プラスチックチューブに DiI 結晶の DiI を溶解させる。30 s のための渦およびアルミニウムホイルを使用して覆われ続ける。
   注:DiI 原液は、数ヶ月間、-20 ° c で暗所で保存することができます。
2. ポリスチレンの小片を5cm の長さ、3cm の幅、および2cm の厚さに切断し、直径9cm のプラスチック皿に接着することによって、魚のホルダー (図 1A) を準備します。ポリスチレンのメスの刃が付いている3cm のボート型の穴を作りなさい。
3. 針の先端に 30-50 cm の長いプラスチックカニューレを加えて、等量システム (図 2) を準備します。
4. 50 mL のプラスチックチューブに、30 mL のリン酸緩衝食塩水溶液 (PBS) で 16% PFA を 10 mL 希釈して、40 mL のフレッシュ 4% パラホルムアルデヒド溶液 (PFA) を調製します。

Results

このプロトコルは、メダカの脳と下垂体の血管を標識し、同時に組織を固定するための段階的な手順を示しています。DiI を含む固定液の心臓注射によって心に標識した後、蛍光実体顕微鏡 (図 4) または共焦点顕微鏡を用いた組織全体に血管を観察することができる (図 5)。厚い組織スライスまたは組織全体のいずれかに、血液脈管構造のアーキテクチャが三次元で観察され得る。組織スライスは、固定の終了後に標準免疫蛍光プロトコルを使用して特定の標的タンパク質に対して、および関心のある細胞が蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニック線で標識することができる (図 6)。これは血管と他の特定の細胞のタイプ間の相互作用の調査を可能にする。ここで例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 産生細胞が下垂体 Lh 細胞²⁸の位置を明らかにしたメダカのトランスジェニック線を使用する。これらの細胞が血管に向かって拡張を送ることを観察すること.......

Discussion

DiI を用いた心臓灌流は、以前は、teleost 魚¹³を含むいくつかのモデル種²⁴において血管を標識するために使用されてきた_。

DiI が脈管系において灌流によって内皮細胞膜に直接送達されるように、固定液中の DiI 濃度を増加させることによってシグナル対雑音比を増加させることができる。さらに、蛍光色素分子は、最小限の漂白で励起すると強烈な染色を行い、比較的長続きする発光^18,30を可能にします。また、ラベリングは数日間残ることができ、immuofluorescence (IF)³¹のような軽度の治療を必要とする他のラベリング技術と組み合わせて使用することができる。

ただし、この方法にはいくつかの制限があります。定着性溶液から除去した後、標識の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	RT 15711
針なし 5 mL シリンジ PP/PE 針なし	シグマ	Z116866-100EA	シリンジ
BD プレシジョングライド シリンジ	シグマ	Z118044-100EA	針 18G (1.20*40)
ホウケイ酸ガラス 10 cm OD 1.2 mm	サッター器具	BF120-94-10	ガラスピペット
DiI(1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩)	Invitrogen	D-282
LDPEチューブ外径1.7 mmおよび内径1.1 mm	Portex	800/110/340/100	カニューレ
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液	シグマ	D8537-6X500ML
ピペットプーラー	成重	PC-10
プラスチックペトリ皿	VWR	391-0442
瞬間接着剤ゲル	loctite	c4356
トリカイン (ms-222)	σ	E10521-50G