Enzymatisk syntese af Epoxidiserede metabolitter af Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic og arachidonsyre
Summary
Vi præsenterer en metode, der er nyttig til storstilet enzymatisk syntese og rensning af specifikke enantiomerer og regioisomerer af Epoxider af arachidonsyre (AA), docosahexaensyre (DHA) og eicosapentaensyre Acid (EPA) med brug af en bakteriel cytokrom P450-enzym (BM3).
Abstract
De epoxidiserede metabolitter af forskellige flerumættede fedtsyrer (PUFAs), såkaldte epoxy fedtsyrer, har en bred vifte af roller i menneskelig fysiologi. Disse metabolitter produceres endogent af cytokrom P450 klassen af enzymer. På grund af deres mangfoldige og potente biologiske virkninger, er der betydelig interesse i at studere disse metabolitter. Bestemmelse af disse metabolitters unikke roller i kroppen er en vanskelig opgave, da epoxy fedtsyrer først skal opnås i betydelige mængder og med høj renhed. Opnåelse af forbindelser fra naturlige kilder er ofte arbejdskraftintensive, og opløselig epoxid hydrolaser (SEH) hydrolyserer hurtigt metabolitterne. På den anden side, at opnå disse metabolitter via kemiske reaktioner er meget ineffektiv, på grund af vanskeligheden ved at opnå rene regioisomerer og enantiomerer, lave udbytter, og omfattende (og dyre) rensning. Her præsenterer vi en effektiv enzymatisk syntese af 19 (s), 20 (r)-og 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) fra DHA via EPOXIDERING med BM3, et bakterielt CYP450-enzym isoleret oprindeligt fra Bacillus megaterium (som let udtrykkes i Escherichia coli). Karakterisering og bestemmelse af renhed udføres med nuklear magnetisk resonansspektroskopi (NMR), højtydende væskekromatografi (HPLC) og massespektrometri (MS). Denne procedure illustrerer fordelene ved enzymatisk syntese af PUFA epoxy metabolitter og gælder for epoxidering af andre fedtsyrer, herunder arachidonsyre (AA) og eicosapentaensyre Acid (EPA) til fremstilling af den analoge epoxyeicosatrienoic henholdsvis EETs og epoxyeicosatetraenoinsyre (EEQs).
Introduction
Som interesse i den rolle, som flerumættede fedtsyrer (især Omega-3 og omega-6 flerumættede fedtsyrer) spiller i menneskets biologi er vokset i de seneste år, forskere har taget notits af den brede vifte af tiltalende fordele, at deres metabolitter Udstille. Især epoxy fedtsyre metabolitter produceret af cytokrom P450 klasse af enzymer har været et stort fokuspunkt. F. eks. spiller mange PUFA Epoxider, herunder epoxyeicosatrienoic syrer (Eets), epoxydocosapentaenoinsyre (EDPs) og epoxyeicosatetraenoinsyre (eeqs), en afgørende rolle i reguleringen af blodtryk og inflammation på1,2 , 3 af , 4 af , 5. interessant, de specifikke enantiomerer og regioisomerer af AA og EPA Epoxider er kendt for at have varierende virkninger på vasokonstriktion6,7. Mens de fysiologiske virkninger af enantiomerer og regioisomerer af EETs og EEQs er dokumenteret, vides der kun lidt om virkningen af de analoge epoxydocosapentaenoinsyre (EDPs) dannet af DHA. Udbredt brug af fiskeolie8, som er rig på både EPA og DHA, har også vakt interesse i EDPs9. Fordelene ved disse kosttilskud menes at være delvis på grund af downstream DHA metabolitter (16, 17-EDP og 19, 20-EDP er den mest rigelige), fordi in vivo niveauer af EDPs koordinerer meget godt med mængden af DHA i kosten10, 11. der er
Undersøgelse af mekanismerne og målene for disse epoxy fedtsyrer ved metabolomics, kemisk biologi og andre metoder har vist sig udfordrende, til dels fordi de findes som blandinger af regio-og stereo-isomerer, og en metode til at opnå rene mængder af der er behov for enantiomerer og regioisomerer. Konventionelle midler til kemisk syntese af disse forbindelser har vist sig ineffektive. Anvendelse af peroxysyrer som meta-chloroperoxybensyre til epoxidering har mange ulemper, især manglen på epoxidation selektivitet, som nødvendiggør dyre og omhyggelige rensning af individuelle regioisomerer og enantiomerer. Total syntese af DHA og EPA metabolitter er muligt, men også lider af ulemper, der gør det upraktisk for storstilet syntese såsom høje omkostninger og lave udbytter12,13. Effektiv samlet produktion kan opnås med enzymatisk syntese, da enzymatiske reaktioner er Regio-og stereo selektive14. Undersøgelser viser, at enzymatisk epoxidering af AA og EPA (med BM3) er både regioselective og enantioselektiv15,16,17,18, men denne procedure er ikke blevet testet med DHA, eller på en stor Skala. Det overordnede mål med vores metode var at opskalere og optimere denne kemo enzymatiske epoxidering for hurtigt at producere betydelige mængder af rene epoxy fedtsyrer som deres individuelle enantiomerer. Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, har forskerne adgang til en enkel og omkostningseffektiv strategi for syntese af EDPs og andre PUFA epoxy metabolitter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi en driftsmæssigt enkel og omkostningseffektiv metode til at forberede de to mest rigelige epoxy metabolitter af DHA-19, 20 og 16, 17-EDP. Disse epoxy fedtsyrer kan tilberedes i meget enantiopure (som deres S, R-isomerer) form ved hjælp af Wild-type BM3 enzym. Flere kritiske punkter, som kan anvendes til fejlfinding, og udvidelse af vores metode til at forberede enantiopure epoxy metabolitter af AA og EPA, er beskrevet nedenfor.
BM3 retningslinjer for opbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er finansieret af r00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) og opstart midler fra Michigan State University. Forfatterne ønsker at takke Dr. jun Yang (University of California at Davis) og Lalitha Karchalla (Michigan State University) for hjælp med optimering af den enzymatiske reaktion, og Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry og metabolomics Facility) for at få hjælp til indsamling af HRMS-data.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. . Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. . Method for the synthesis of DHA. , (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- . Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019)
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
