शुक्राणु सफलतापूर्वक अंडवाहिनी के माध्यम से नेविगेट करने के लिए एक oocyte खाद चाहिए । यहां, हम सी एलिगेंस उभयलिंगी गर्भाशय के भीतर शुक्राणु प्रवास को मापने के लिए एक परख का वर्णन । यह परख संभोग के बाद गर्भाशय के भीतर शुक्राणु वितरण पर मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में गति पर, दिशात्मक वेग, और उलटा आवृत्ति ।
सफल निषेचन यौन प्रजनन के लिए मौलिक है, अभी तक थोड़ा तंत्र है कि महिला प्रजनन पथ के भीतर oocytes के लिए शुक्राणु गाइड के बारे में जाना जाता है । जबकि इन विट्रो अध्ययनों का सुझाव है कि आंतरिक निषेचन जानवरों के शुक्राणु अपने आसपास से विभिंन संकेतों का जवाब कर सकते हैं, महिला प्रजनन पथ के अंदर उनके व्यवहार कल्पना असमर्थता शुक्राणु प्रवास को समझने के लिए एक चुनौती पैदा करता है और अपने मूल वातावरण में गतिशीलता । यहां, हम सी एलिगेंस कि इस सीमा से अधिक है और उनके पारदर्शी epidermis का लाभ लेता है का उपयोग कर एक विधि का वर्णन । C. एलिगेंस एक माइटोकॉन्ड्रियल डाई के साथ दाग पुरुषों वयस्क उभयलिंगी के साथ mated कर रहे हैं, जो संशोधित महिलाओं के रूप में काम करते हैं, और जमा fluorescently शुक्राणु के उभयलिंगी गर्भाशय में लेबल । प्रवास और लेबल शुक्राणु की गतिशीलता तो सीधे एक जीवित hermaphrodite में एक epi-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ट्रैक किया जा सकता है । जंगली प्रकार के पशुओं में, गर्भाशय के माध्यम से लेबल शुक्राणु क्रॉल के लगभग ९०% और निषेचन साइट, या spermatheca तक पहुंचने । गर्भाशय के चित्र गर्भाशय के भीतर शुक्राणु के वितरण का आकलन करने के लिए सहवास के बाद 1 ज लिया जा सकता है और शुक्राणुता तक पहुंचने वाले शुक्राणु का प्रतिशत । वैकल्पिक रूप से, समय-चूक छवियों शुक्राणु गति, दिशात्मक वेग और उलटा आवृत्ति का आकलन करने के लिए संभोग के बाद तुरंत लिया जा सकता है । इस विधि के अंय आनुवंशिक और आणविक सी. elegans के लिए उपलब्ध उपकरणों के साथ संयुक्त किया जा सकता है उपंयास आनुवंशिक और आणविक तंत्र है कि महिला प्रजनन पथ के भीतर शुक्राणु मार्गदर्शन और गतिशीलता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है की पहचान ।
आण्विक क्रियाविधि जिसके द्वारा शुक्राणुजीवी (शुक्राणु के रूप में संदर्भित) अंडकोशिका की ओर मादा प्रजनन पथ के माध्यम से नेविगेट करने के लिए अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं, अभी तक यौन प्रजनन के लिए मौलिक हैं । शुक्राणु गतिशीलता अत्यधिक गतिशील है और मजबूत संचार संकेतों पर निर्भर करता है कि शुक्राणु वेग और दिशात्मक गतिशीलता मेंपरिवर्तन 1,2,3,4,5,6 , 7 । , 8 । , 9 , 10 , 11 , 12. सी एलिगेंस विवो में शुक्राणु आंदोलन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बन गया है क्योंकि उभयलिंगी की पारदर्शी एपिडर्मिस एकल कोशिका संकल्प2,3, पर लाइव शुक्राणु की ट्रैकिंग परमिट 8,10. इस कागज का उद्देश्य सी एलिगेंस उभयलिंगी गर्भाशय के भीतर शुक्राणु आंदोलन का आकलन करने के लिए तरीके प्रदान करना है ।
पशु प्रजातियों में जहां शुक्राणु और अंडक बाहरी वातावरण में मिलने (यानी, acquatic वातावरण), शुक्राणु chemotactic द्वारा स्रावित संकेतों को जवाब । इन संकेतों को शुक्राणु आंदोलन की दिशा गाइड, उंहें लाने के करीब संकेत स्रोत4,6,11। हालांकि, बहुत कम प्रजातियों में शुक्राणु आंदोलन है कि आंतरिक खाद के बारे में जाना जाता है । एक बड़ी चुनौती मादा प्रजनन पथ की वास्तुकला है, जो अधिकांश प्रजातियों में माइक्रोस्कोपी के लिए दुर्गम है । मनुष्यों में इन विट्रो अध्ययन, चूहों, और सूअरों, उदाहरण के लिए, सबूत है कि शुक्राणु की subpopulations chemoattractants, द्रव प्रवाह, और थर्मल gradients1,5,7,9के लिए प्रतिक्रिया कर सकते है प्रदान करते हैं, १२। इन पद्धतियों के साथ, के लिए कल्पना और vivo में शुक्राणु आंदोलन ट्रैक करने में असमर्थता रणनीतियों पर गंभीर सीमाओं इन कार्यों को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण तंत्र की खोज ।
इन सीमाओं से उबरने के लिए, हम सूत्रकृमि C. एलिगेंस का उपयोग करने के तरीकों का विकास किया है सीधे गर्भाधान के बाद शुक्राणु कल्पना, vivo में व्यक्तिगत शुक्राणु प्रवास मापदंडों को मापने के लिए, और एक शुक्राणु जनसंख्या की क्षमता को मापने के लिए लक्ष्य उर्वरीकरण स्थल । इन तरीकों, एक साथ सी एलिगेंस आणविक और आनुवंशिक toolset के साथ, रासायनिक संकेतन अणुओं और आणविक मशीनरी है कि शुक्राणु गतिशीलता व्यवहार को विनियमित की खोज की सुविधा । मसलन, वीवो13में दक्ष स्पर्म मूवमेंट के लिए जरूरी जीन की पहचान करने के लिए हर्मारोडिटीज या पुरुषों में जेनेटिक स्क्रीन का आयोजन किया जा सकता है । अणुओं में शुक्राणु सक्रियण, प्रवास वेग, और दिशात्मक गतिशीलता पर प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए उभयलिंगी गोंड़ में इंजेक्ट किया जा सकताहै । साथ ही, वर्णित विधियों में अस्थानिक बॉडी स्थान rogue स्पर्म माइग्रेशन की निगरानी करने के लिए और शुक्राणु प्रतियोगिता10,14का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
C. एलिगेंस प्रकृति में hermaphrodites और पुरुषों के रूप में मौजूद ( चित्रा 1देखें). उभयलिंगी गोनाद में दो U-आकार के हथियार हैं, जो एक-दूसरे की दर्पण छवियां हैं । L4 लार्वा अवस्था के दौरान, सबसे समीपस्थ जनन कोशिकाएं (अर्थात शुक्रप्रावरक के निकट की कोशिकाएं) शुक्राणुजनन से गुजरती हैं । प्रत्येक प्राथमिक शुक्राणुकोशिका अर्धसूत्रण में प्रवेश करती है और चार अगुणित शुक्राणुकोशिकाओं का उत्पादन करता है । इन शुक्राणुता को पहले परिपक्व अंडकोशिका के साथ-साथ शुक्रमैथीका में धकेल दिया जाता है और इसकी स्पर्मिजनन15से गुजरना होता है । वयस्क उभयलिंगी, शुक्राणुजनन से अंडजनन में परिवर्तित हो जाते हैं । Oocytes गोंड़ के साथ एक विधानसभा लाइन फैशन में परिपक्व, gonad के समीपस्थ अंत में सबसे परिपक्व oocytes के साथ, spermatheca के बगल में । शुक्राणु से एमएसपी संकेतों अर्धसूत्री परिपक्वता और ovulation16,17ट्रिगर करने के लिए की जरूरत है । दूसरी ओर नर सी एलिगेंसके पास एक जे के आकार का गोंड़ होता है जो केवल शुक्राणु का उत्पादन करता है । शुक्राशय को लाभदायक पुटिका में भंडारित किया जाता है । उभयलिंगी या मादा के साथ संभोग करने पर, पुरुष पूंछ के पास के कंटिका को योनी में प्रविष्ट करता है । Spermatids स्खलन के दौरान सक्रिय कर रहे हैं, जब वे लाभदायक द्रव के साथ संपर्क में आते हैं18. C. एलिगेंस शुक्राणु तैरना नहीं है क्योंकि वे नहीं कर रहे है कशाभ । इसके बजाय, वे गति के लिए स्यूडोपॉड का उपयोग कर, प्रजनन पथ के माध्यम से क्रॉल । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि पुरुष शुक्राणु, जो आकार में बड़ा कर रहे हैं, उभयलिंगी शुक्राणु14से अधिक प्रतिस्पर्धी लाभ है ।
इस विधि में, पुरुष सी एलिगेंस शुक्राणु दाता के रूप में कार्य और वयस्क hermaprhodites करने के लिए mated कर रहे हैं. वयस्क पुरुषों एक फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल डाई लेबल शुक्राणु का उत्पादन करने के साथ दाग रहे हैं । एक बार उभयलिंगी योनी के माध्यम से जमा, शुक्राणु गर्भाशय में शुक्राणुप्रावरक, या निषेचन साइट के लिए भ्रूण के आसपास क्रॉल करना होगा । सी एलिगेंस मॉडल के पारदर्शी एपिडर्मिस प्रत्येक व्यक्ति के शुक्राणु के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है के रूप में यह महिला प्रजनन पथ के माध्यम से पर नेविगेट करता । हाल के वर्षों में, हमारे प्रयोगशाला सफलतापूर्वक इस विधि का इस्तेमाल किया है के लिए एक वर्ग के महत्व को प्रदर्शित करने के एफ श्रृंखला prostaglandins योनी से शुक्राणु के मार्गदर्शक में शुक्राणुका19,20। उभयलिंगी और शुक्राणु की प्रतिक्रिया द्वारा इसके संश्लेषण को नियंत्रित करने वाले आणविक यंत्राशय अभी भी जांच के घेरे में हैं । हालांकि, शुक्राणु गतिशीलता और प्रवास का आकलन करने के लिए इस विधि बहुत महत्वपूर्ण खिलाड़ियों की पहचान है कि नियंत्रण शुक्राणु और अंडक संचार आंतरिक रूप से उपजाऊ जानवरों में सुविधा । निंनलिखित प्रोटोकॉल कैसे इस परख प्रदर्शन करने के लिए कदम से कदम का वर्णन ।
शुक्राणु की क्षमता जटिल महिला प्रजनन पथ नेविगेट और oocytes खोजने के लिए यौन प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण है । हाल ही में अध्ययन के शुक्राणु का उपयोग कर आंतरिक fertilizing पशुओं का सुझाव है कि वे सक्रिय रूप से विभिंन पर्यावरण cues का जवाब, रासायनिक संकेतों सहित, द्रव प्रवाह, और तापमान1,5,7, 9 , 12. तथापि, इन टिप्पणियों काफी हद तक इन विट्रो प्रयोगों से हुई है और थोड़ा शुक्राणु व्यवहार और प्रजनन पथ के भीतर संचार के बारे में जाना जाता है । शुक्राणु प्रवास और गतिशीलता पर vivo डेटा में प्राप्त करने के लिए मुख्य बाधाओं में से एक ज्यादातर महिला प्रजनन इलाकों के भीतर दृश्यता की कमी है । विधि हम यहां वर्णित है C. एलिगेंस का उपयोग कर इस सीमा पर काबू पा है । प्रतिनिधि के रूप में परिणाम प्रदर्शित करता है, पारदर्शी एपिडर्मिस प्रत्यक्ष दृश्य और एक जीवित, अक्षुण्ण जीव में एकल कोशिका के संकल्प पर प्रत्येक शुक्राणु की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है ।
C. एलिगेंस दो लिंगों है । पुरुष, एक XO जीनोटाइप के साथ, केवल शुक्राणु का उत्पादन, और इस विधि में, शुक्राणु दाताओं के रूप में उपयोग किया जाता है । एक XX जीनोटाइप के साथ hermaphrodite, संशोधित महिलाओं रहे हैं । उनके जननग्रन्थि पहले चौथे लार्वा चरण के दौरान शुक्राणुजनन से गुजरना और वयस्कता25में अंडजनन के लिए स्विच । इस परख वयस्क hermaphrodites, जिसका प्रजनन ऊतकों महिला प्रजनन पथ के लिए एक मॉडल प्रदान का उपयोग करता है । इस परख में दोनों लिंगों के उपयोग की अनुमति देता है हम दोनों पुरुष और महिला में आनुवंशिक और आणविक रास्ते की पहचान है कि शुक्राणु मार्गदर्शन और गतिशीलता को विनियमित कर सकते हैं । सी एलिगेंसके लिए उपलब्ध आनुवंशिक और आणविक तकनीकों की पूरी मेजबानी के साथ संयुक्त, इस विधि शुक्राणु प्रवास और गतिशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शुक्राणु और अंडक संचार में उपंयास अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम आगे विचार, प्रोटोकॉल अनुभाग में उपलब्ध कराए गए विवरण के अलावा वारंट ।
कीड़े
कोहरा-2 (q71), उसे-5 (e1490), या उसके-8 (e1489) उत्परिवर्ती नर का उपयोग द1 नर के स्थान पर किया जा सकता है । ये म्यूटेशन संस्कृतियों में पुरुषों की बारंबारता बढ़ाते हैं, लेकिन पुरुष सहवास या स्पर्म फंक्शन्स को प्रभावित नहीं करते13। महिलाओं, जैसे कोहरा-2 (q71) महिलाओं, hermaphrodites के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, महिलाओं के पुरुषों के साथ पहले से mated किया जाना चाहिए करने के लिए उचित अंडक विकास की अनुमति । इस पूर्व समागम से निषेचित भ्रूण की उपस्थिति यह भी सुनिश्चित करती है कि गर्भाशय लंबे समय तक ठीक से शुक्राणु वितरण का आकलन करने के लिए पर्याप्त है । यदि उत्परिवर्ती या प्रयोगात्मक hermaphrodites का मूल्यांकन किया जा रहा है, एक नियंत्रण समूह (ओं) शामिल हैं । उदाहरण के लिए, उत्परिवर्ती hermaphrodites wildtype N2 के साथ जोड़ा जाना चाहिए, परख में अंय चर के लिए एक नियंत्रण के रूप में hermaphrodites । शाही सेना के हस्तक्षेप के लिए plasmids युक्त बैक्टीरिया के साथ खिलाया गया है कि hermaphrodites भी खाली वेक्टर नियंत्रण युक्त बैक्टीरिया के साथ खिलाया जाना चाहिए. योनी से दूरी, जहां शुक्राणु गर्भाधान कर रहे हैं, शुक्रप्रावरक, निषेचन स्थल, गर्भाशय में अंडे की संख्या के आधार पर भिंन हो सकते है (यानी गर्भाशय अंडे की संख्या में वृद्धि के साथ फैलता है) । यदि जीनोटाइप के बीच तुलना की जाए, तो उन उभयलिगों का चयन करें जिनके गर्भाशय में अंडे की समान संख्या होती है । भ्रूण के अंडे सेने या लार्वा को हिलाने वाले उभयलिंगी का चयन न करें । समय के साथ-साथ यह भी पता लगाया जा सकता है कि जिस उम्र में उभयलिंगी होना चाहिए, उसकी पहचान कैसे की जाए ।
हेम्मरोडाइटीज और नर उठा
यह महत्वपूर्ण है कि इस परख के लिए उठाया hermaphrodites ऊंचा हो गया या भूखे प्लेटों से नहीं हैं । खाद्य और फेरोमोन cues डीएएफ-7, एक tgfß homolog की अभिव्यक्ति मिलाना । DAF-7 मार्ग दिखाया गया है एफ श्रृंखला prostaglandins के संश्लेषण को विनियमित है कि शुक्राणुप्रावरक के लिए शुक्राणु मार्गदर्शक में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं20. अधिक भीड़ या भूखे प्लेटों से hermaphrodites उठा गरीब शुक्राणु मार्गदर्शन ब्याज के लक्ष्य से संबंधित नहीं में परिणाम हो सकता है । प्लेटों की सघनता से पुरुष के शुक्राणुओं पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता । हालांकि, पुरुषों है कि बहुत युवा या बहुत पुराने है कम संभोग क्षमता में परिणाम हो सकता है (यानी, संभोग प्लेट पर hermaphrodites का प्रतिशत है कि उनके यूट्रस यानी गर्भाशय में पर्याप्त शुक्राणु है मात्रा) । 1-3 दिन पुराने वयस्क नर इस परख23के लिए इष्टतम हैं ।
हर्माचनीयकरण
हमारे हाथों में, Tetramisole और Tricaine संयोजन यह सुनिश्चित करता है कि कीड़े को स्थिर कर रहे हैं, और संभोग और छवि अधिग्रहण के दौरान जीवित रहते हैं । अन्य anesthetics, जैसे सोडियम azide, भी इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, सोडियम ऐज़ाइड अत्यधिक विषाक्त है और शर्तों को मानकीकृत करने की आवश्यकता है । Immobilization तकनीक microbeads, agarose, और microfluidics कक्षों का उपयोग कर के रूप में वे संभोग के साथ हस्तक्षेप की सिफारिश नहीं कर रहे हैं ।
पुरुष धुंधला
इस पांडुलिपि में इस्तेमाल mito-डाई, mitotrackercmxros, व्यापक रूप से शुक्राणु लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से अन्य mitochondria, सी एलिगेंसमें. इस mito-डाई के साथ लेबल शुक्राणु पूरी तरह कार्यात्मक है, अपनी क्षमता को बनाए रखने के लिए सक्रिय हो, प्रवास, खाद oocytes, और व्यवहार्य संतान26,27का उत्पादन । अन्य माइटोकॉन्ड्रियल रंगों, जैसे रोडैमाइन 6g और DiOC6 को सी. एलिगेंस माइटोकॉन्ड्रिया28,29को दाग लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इन रंगों के लिए शर्तों को इस परख में शुक्राणु लेबलिंग के लिए मानकीकृत की जरूरत है । Mitochrondrial लेबलिंग तंत्र के अलावा, इस तरह के Syto17 के रूप में डीएनए दाग, भी प्रवास के लिए शुक्राणु लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है assays हैं30. जबकि इन तकनीकों लेबलिंग अपेक्षाकृत आसान है और प्रदर्शन करने के लिए जल्दी कर रहे हैं, ट्रांसजेनिक रणनीतियों को भी शुक्राणु उत्पंन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि व्यक्त शुक्राणु विशिष्ट प्रमोटरों के तहत फ्लोरोसेंट टैग31,३२।
संभोग
संभोग बिंदु है कि बहुत मोटी संभोग क्षमता कम हो सकती है । देखभाल संभव के रूप में छोटे बैक्टीरिया के रूप में हस्तांतरण करने के लिए लिया जाना चाहिए जब पुरुषों और anesthetized संभोग डॉट पर hermaphrodites स्थानांतरित ।
आगरोस पैड बनाने और कवर पर्ची रखने
एयर बुलबुले agarose पैड में उत्पन्न किया जा सकता है । वे छवि अधिग्रहण के दौरान प्रकाश refract कर सकते है या, जब काफी बड़े, कीड़े के माध्यम से गिर करने के लिए, यह छवि (ओं) प्राप्त करने के लिए असंभव बना । इसी तरह, हवा बुलबुले hermaphrodites के साथ बनाया जा सकता है जब कवर पर्ची उनके ऊपर agarose पैड पर रखा गया है । इन बुलबुले प्रकाश refract और छवि गुणवत्ता में कमी के लिए सीसा । अभ्यास हवा बुलबुले की घटना को कम करने में मदद मिलेगी ।
परिमाणन
जब मात्रा शुक्राणु वितरण, एक कीड़ा के गर्भाशय के माध्यम से विभिन्न जेड-विमानों शुक्राणु वितरण में मामूली अंतर हो सकता है । हम पाते हैं कि एक ही चित्र पर ध्यान केंद्रित spermatheca हमें प्रदान करता है कि परिणाम के समान हैं reproducible परिणाम कई z-वर्गों औसत द्वारा प्राप्त. हम अनुशंसा करते है spermatheca के केंद्र पर छवि ध्यान केंद्रित है, लेकिन फोकल विमानों थोड़ा बदल सकता है के आधार पर है experimenter की जरूरत है । यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कि सभी छवियों को एक ही तरीके से लिया जाता है । इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि केवल शुक्राणु कि ध्यान में है गिना जाता है । यह इन-फोकस स्पर्म के लिए मापदंड निर्धारित करने में काउंटर का विवेकाधिकार है । तथापि, यह महत्वपूर्ण है कि मापदंड व्यवस्थित रूप से हर उस कृमि को लागू किया जाता है जिसका परिमाण निर्धारित है । शुक्राणु ट्रैकिंग के लिए, कई सॉफ्टवेयर स्वत: ट्रैकिंग क्षमताओं की पेशकश करते हैं । हालांकि, हम पाते है कि मैनुअल ट्रैकिंग दो मुख्य कारणों के लिए सॉफ्टवेयर के स्वत: ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म outperforms है 1) सीमित स्थान के भीतर इसी तरह के आकार के नाभिक की बहुतायत यह मुश्किल सॉफ्टवेयर के लिए व्यक्तिगत शुक्राणु के बीच भेद करने के लिए बनाता है और प्रत्येक शुक्राणु के लिए परिभाषित ROIs बनाएं । 2) के रूप में शुक्राणु में और ध्यान से बाहर जाना है, उनकी तीव्रता बदलाव, यह मुश्किल सॉफ्टवेयर के लिए समय की विस्तारित अवधि में शुक्राणु का ट्रैक रखने के लिए कर रही है ।
The authors have nothing to disclose.
हम ईमानदारी से अपने स्वर्गीय संरक्षक, डॉ माइकल मिलर, उनके प्रेरक और निस्वार्थ सदस्यता और एक उपकरण के लिए बेहतर शुक्राणु और अंडक संचार समझ के रूप में इस विधि के निर्माण के लिए धंयवाद । उनके अचानक निधन से उनके परिवार, उनकी प्रयोगशाला और वैज्ञानिक समुदाय को जबर्दस्त नुकसान हुआ है । इस अध्ययन को एनआईएच (R01GM085105 से एमएएम और F30HD094446 से एमएच) का समर्थन मिला । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।
Reagents and Material | |||
60mm x 15mm Petri Dish | Fisher | FB0875713A | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
N2 | CGC | N2 | |
fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
Platinum wire 0.25mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
Watch glass | Fisher | 02-612A | |
5mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20°C |
Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20°C. |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20°C |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
16°C and 20°C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |