Spermier måste framgångs rikt navigera genom utväxande att gödsla en oocyte. Här beskriver vi ett test för att mäta spermie migration i C. elegans hermafrodit livmodern. Denna analys kan ge kvantitativa uppgifter om spermie distribution i livmodern efter parning, liksom på hastighet, riktnings hastighet, och återföring frekvens.
Framgångs rik befruktning är grundläggande för sexuell reproduktion, men lite är känt om de mekanismer som vägleder spermier till oocyter inom den kvinnliga fortplantnings organen. Medan in vitro-studier tyder på att spermier av internt gödande djur kan reagera på olika led trådar från sin omgivning, oförmågan att visualisera sitt beteende i den kvinnliga fortplantnings organen skapar en utmaning för att förstå spermier migration och mobilitet i den egna miljön. Här, vi beskriver en metod med C. elegans som övervinner denna begränsning och drar nytta av deras transparenta epidermis. C. elegans hanar färgade med ett mitokondriskt färg ämne paras med vuxna hermafroditer, som fungerar som modifierade Honor, och insättning fluorescensmarkerade märkt sperma i hermafrodit livmodern. Migrationen och motiliteten hos de märkta spermierna kan sedan spåras direkt med hjälp av ett Epi-fluorescensmikroskop i en levande hermafrodit. I vild-typ djur, cirka 90% av den märkta spermier krypa genom livmodern och nå befruktningen platsen, eller spermatheca. Bilder av livmodern kan tas 1 h efter parning för att bedöma fördelningen av spermier i livmodern och andelen spermier som har nått spermatheca. Alternativt kan tids fördröjnings bilder tas omedelbart efter parning för att bedöma spermie hastighet, riktnings hastighet och återförings frekvens. Denna metod kan kombineras med andra genetiska och molekyl ära verktyg tillgängliga för C. elegans för att identifiera nya genetiska och molekyl ära mekanismer som är viktiga för att reglera spermie vägledning och motilitet inom den kvinnliga fortplantnings organen.
De molekyl ära mekanismer genom vilka spermier (kallas spermier) navigera genom den kvinnliga fortplantnings organen mot oocyt är inte väl förstått, men är grundläggande för sexuell reproduktion. Spermie motilitet är mycket dynamisk och beror på robusta kommunikations signaler som förändrar spermie hastighet och riktad motilitet1,2,3,4,5,6 , 7 för att , 8 , 9 för att , 10 , 11 för att , 12. C. elegans har blivit en kraftfull modell för att studera spermie rörelse in vivo eftersom hermafrodit är transparent epidermis tillåter spårning av levande spermier vid encellig upplösning2,3, 8,10. Syftet med detta dokument är att tillhandahålla metoder för att bedöma spermie rörelser inom C. elegans hermafrodit livmodern.
I djur arter där sperma och äggcell möts i den yttre miljön (dvs., acquatiska miljöer), reagerar spermier på kemotaktiska signaler som utsöndras av oocyter. Dessa signaler styra riktningen av spermie rörelse, föra dem närmare signal källa4,6,11. Men mycket mindre är känt om spermie rörelse hos arter som gödsla internt. En stor utmaning är uppbyggnaden av den kvinnliga fortplantnings organen, som är otillgänglig för mikroskopi i de flesta arter. In vitro-studier på människor, möss och svin, till exempel, ge belägg för att subpopulationer av spermier kan reagera på chemoattractants, vätske flöde, och termiska gradienter1,5,7,9, med 12. Med dessa system, oförmåga att visualisera och spåra spermie rörelse in vivo platser allvarliga begränsningar på strategier för att upptäcka de viktigaste mekanismerna som reglerar dessa funktioner.
För att övervinna dessa begränsningar har vi utvecklat metoder som använder Nematoden C. elegans för att direkt visualisera spermier efter insemination, för att mäta individuella spermie migration parametrar in vivo, och för att mäta förmågan hos en spermie population att rikta gödsel platsen. Dessa metoder, tillsammans med C. elegans molekylär och genetisk verktygs låda, under lätta upptäckten av kemiska signal molekyler och molekyl ära maskiner som reglerar spermie motilitet beteenden. Till exempel kan genetiska skärmar utföras i hermafroditer eller hanar för att identifiera gener som är nödvändiga för effektiv spermie rörelse in vivo13. Molekyler kan injiceras i hermafrodit gonaden att testa för effekter på spermier aktivering, migration hastighet, och riktad motilitet3. Dessutom kan de beskrivna metoderna användas för att övervaka oseriösa spermier migration till ektopisk organ platser och för att utvärdera spermier konkurrens10,14.
C. elegans finns i naturen som hermafroditer och hanar (se figur 1). Den hermafrodit gonaden har två U-formade armar som är spegel bilder av varandra. De mest proximala köns cellerna (dvs. cellerna nära spermatheca) genomgår en spermatogenes under det larvstadium L4. Varje primär spermatocyter går in i meios och producerar fyra haploida spermatider. Dessa spermatider skjuts in i nektar tillsammans med den första mogna äggcell och genomgå spermiogenesis15. Adult hermafroditer byta från spermatogenes till oogenesis. Oocyter mogna i en monterings linje mode längs gonaden, med de mest mogna äggcell i proximala änden av gonaden, bredvid spermatheca. MSP signaler från spermier behövs för att utlösa meiotiska mognad och ägg lossning16,17. Hane C. elegans, å andra sidan, har en J-formad gonad som producerar endast spermier. Spermatiderna lagras i sävvesikeln. Vid parning med hermafrodit eller hona, infogar hanen balkar nära svansen i vulva. Spermatider aktive ras under utlösning, när de kommer i kontakt med sädesvätskan18. C. elegans spermier simma inte eftersom de inte flagellated. Istället, de krypa genom fortplantnings organen, med hjälp av pseudopod för förflyttning. Det är väl etablerat att manliga spermier, som är större i storlek, har en konkurrens för del över hermafrodit spermier14.
I denna metod, hane C. elegans fungera som spermie donator och paras till vuxna hermaprhodites. Vuxna män är färgade med en fluorescerande mitokondriell färg till producerade märkta spermier. När de har deponerats genom hermafrodit vulva måste sperman krypa runt embryona i livmodern mot spermatheca, eller befruktning plats. Den genomskinliga epidermis av C. elegans modellen möjliggör direkt visualisering av varje enskild sperma som navigerar genom kvinnliga fortplantnings organen. Under de senaste åren har vårt labb framgångs rikt använt denna metod för att demonstrera vikten av en klass av F-seriens prostaglandiner i väg LED ande spermier från vulva till nektar19,20. De molekyl ära mechansierna som styr dess syntes av hermafrodit och reaktionen från sperman är fortfarande under utredning. Men denna metod för att bedöma spermie rörlighet och migration underlättar avsevärt identifieringen av de viktigaste aktörerna som kontrollerar spermier och äggcell kommunikation i internt befruktande djur. Följande protokoll beskriver steg för steg hur du utför denna analys.
Möjligheten för spermier att navigera den invecklade kvinnliga fortplantnings organen och hitta oocyter är avgörande för sexuell reproduktion. Nyligen genomförda studier med hjälp av sperma från internt befruktande djur tyder på att de aktivt reagera på olika miljömässiga signaler, inklusive kemiska signaler, vätske flöde och temperaturgradienter1,5,7, 9 för att , 12. dessa observationer har dock till stor del resulterat från in vitro-experiment och lite är känt om spermie beteende och kommunikation inom fortplantnings organen. Ett av de största hindren för att förvärva in vivo data om spermie migration och motilitet är bristen på synlighet inom de flesta kvinnliga reproduktiva Tracts. Den metod som vi har beskrivit här med hjälp av C. elegans övervinner denna begränsning. Som representativa resultat visar, möjliggör den transparenta epidermis för direkt visualisering och spårning av varje sperma vid enkel cell upplösning i en levande, intakt organism.
C. elegans har två kön. Hanarna, med en XO genotyp, producerar endast spermier, och i denna metod, används som spermie donatorer. Hermafrodit, med en XX genotyp, är modifierade Honor. Deras gonader först genomgå spermatogenes under den fjärde larv scenen och byta till oogenesen i vuxen ålder25. Denna analys använder vuxna hermaphrodites, vars reproduktiva vävnader ger en modell för den kvinnliga fortplantnings organen. Utnyttjandet av båda könen i denna analys gör att vi kan identifiera genetiska och molekyl ära vägar i både manliga och kvinnliga som kan reglera spermie vägledning och motilitet. Kombinerat med hela den mängd genetiska och molekyl ära tekniker som finns tillgängliga för C. elegans, kan denna metod leda till nya insikter i spermie migration och motilitet samt sperma-och oocytkommunikation.
Några viktiga steg i detta protokoll motiverar ytterligare överväganden, utöver de uppgifter som anges i avsnittet protokoll.
Maskar
fog-2 (Q71), him-5 (e1490), eller honom-8 (e1489) Mutant hanar kan användas i stället för N2 hanar. Dessa mutationer ökar frekvensen av män i kulturer, men påverkar inte manliga parning eller spermier funktioner13. Honor, såsom fog-2 (Q71) Honor, kan användas i stället för hermaphrodites. Emellertid, Honor måste vara pre-Parade med män för att möjliggöra korrekt äggcell utveckling. Närvaron av befruktade embryon från denna pre-parning garanterar också att livmodern är tillräckligt lång för att korrekt bedöma spermie distributionen. Om muterade eller experimentella hermaphroditer bedöms, inkludera en kontroll grupp (er). Till exempel bör muterade hermafroditer paras ihop med vildtyp N2 hermafroditer som en kontroll för andra variabler i analysen. Hermaphrodites som har utfodrats med bakterier som innehåller plasmider för RNA interferens analyser bör också matas med bakterier som innehåller Tom vektor kontroll. Avståndet från vulva, där spermier insemineras, till spermatheca, befruktningen platsen, kan variera beroende på antalet ägg i livmodern (dvs. livmodern expanderar med ökande ägg nummer). Om jämförelser mellan genotyper görs, Välj hermafroditer vars livmödrar innehåller liknande antal ägg. Välj inte hermafroditer som innehåller kläcknings embryon eller rörliga larver. En tids kurs kan utföras för att identifiera den optimala ålder vid vilken hermafroditer bör analyseras.
Plockning hermafroditer och hanar
Det är viktigt att hermafroditer plockas för denna analys är inte från igenväxtas eller svalt tallrikar. Mat och feromon Cues modulera uttrycket av DAF-7, en TGFß homolog. DAF-7 vägen har visats reglera syntesen av F-serien prostaglandiner som spelar viktiga roller i att vägleda spermier till nektar20. Plocka hermafroditer från överfulla eller svalt plattor kan resultera i dålig spermie vägledning inte relaterade till målet av intresse. Tätheten av plattorna verkar inte påverka den manliga spermier. Men, män som är för unga eller för gamla kan resultera i minskad parnings effektivitet (dvs, den procent av hermafroditerna på parnings plattan som har tillräckligt med spermier i sin livmödrar att kvantifiera). 1-3 dag gamla vuxna män är optimala för denna analys23.
Anesthetizing hermafroditer
I våra händer, den Tetramisole och Tricaine kombinationen säkerställer att maskar är immobiliserade, och förbli vid liv under parning och bild förvärv. Andra anestetika, såsom natriumazid, kan också användas. Emellertid, natriumazid är mycket giftigt och tillstånd måste standardiseras. Immobilisering tekniker med hjälp av Mikrokulor, agarose, och mikrofluidik kammare rekommenderas inte eftersom de stör parning.
Utvändig färgning
Mito-Dye som används i detta manuskript, MitoTrackerCMXRos, har i stor utsträckning använts för märkning av spermier, liksom andra mitokondrier, i C. elegans. Sperman märkt med detta Mito-Dye är fullt funktionell, behåller sin förmåga att aktive ras, migrera, gödsla oocyter, och producera livskraftiga avkomma26,27. Andra mitokondriella färg ämnen, såsom rodamin 6G och DiOC6 har använts för att färga C. elegans mitokondrier28,29. Emellertid, villkor för dessa färg ämnen måste standardiseras för märkning spermier i denna analys. Förutom mitochrondrial etiketteringsmekanismer, DNA fläckar, såsom Syto17, kan också användas för att märka spermier för migration analyser30. Även om dessa märknings tekniker är relativt enkla och snabba att utföra, kan transgena strategier också användas för att generera spermier som uttrycker fluorescerande Taggar under spermie specifika initiativtagare31,32.
Parning
Parnings punkter som är för tjocka kan minska parnings effektiviteten. Försiktighet bör iakttas för att överföra så lite bakterier som möjligt vid överföring av män och sövda hermafroditer på parnings punkten.
Att göra AGA ros kuddar och placera täckglasen
Luft bubblor kan genereras i AGA ros kuddar. De kan bryta ljus under Bild insamling eller, när tillräckligt stor, orsaka maskar att falla igenom, vilket gör det omöjligt att förvärva bilden (s). Likaså kan luft bubblor skapas längs hermafroditer när täckglasen placeras över dem på AGA ros pad. Dessa bubblor bryter ljuset och leder till minskad bild kvalitet. Övning kommer att bidra till att minska förekomsten av luft bubblor.
Kvantifiering
Vid kvantifiering av spermie fördelningen kan olika z-plan genom livmodern hos en mask ha små skillnader i spermie distributionen. Vi finner att ta en enda bild fokuserad på nektar ger oss reproducerbara resultat som liknar resultat som erhållits genom genomsnitt flera z-sektioner. Vi rekommenderar att fokusera bilden på mitten av spermatheca, men fokalplan kan ändras något baserat på experimenterarens behov. Det är dock viktigt att alla bilder tas på samma sätt. Dessutom är det viktigt att endast spermier som är i fokus räknas. Det är räknarens diskretion när det gäller att fastställa kriterierna för spermier i fokus. Det är dock viktigt att kriterierna tillämpas systematiskt på varje mask som kvantifieras. För spermie spårning, många program erbjuder automatisk spårning kapacitet. Men vi tycker att manuell spårning överträffar program varans automatiska spårningsalgoritm av två huvudsakliga skäl: 1) överflödet av liknande stora kärnor inom det trånga utrymmet gör det svårt för program varan att skilja mellan enskilda spermier och skapa definierade ROIs för varje sperma. 2) som spermier gå in och ut ur fokus, deras intensitet SKIFT, vilket gör det svårt för program varan att hålla koll på spermier under längre tids perioder.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar uppriktigt vår sena mentor, Dr Michael Miller, för hans inspirerande och osjälviska mentors Kap och skapandet av denna metod som ett verktyg för att bättre förstå spermier och äggcell kommunikation. Hans plötsliga bortgång har varit en oerhörd förlust för hans familj, hans labb och vetenskaps samfundet. Denna studie stöddes av NIH (R01GM085105 till MAM och F30HD094446 till MH). Innehållet är helt och hållet författarens ansvar och representerar inte nödvändigt vis de officiella åsikterna hos de nationella hälso instituten.
Reagents and Material | |||
60mm x 15mm Petri Dish | Fisher | FB0875713A | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
N2 | CGC | N2 | |
fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
Platinum wire 0.25mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
Watch glass | Fisher | 02-612A | |
5mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20°C |
Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20°C. |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20°C |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
16°C and 20°C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |