Описан опростываемый здесь простой метод очистки генного продукта в Streptococcus mutans. Этот метод может быть выгодным в очищении белков, особенно мембранных белков и белков высокой молекулярной массы, и может быть использован с различными другими бактериальными видами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Разочаивание функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа и штаммов, в которых ген интереса был нарушен. Потеря функции после нарушения гена впоследствии восстанавливается экзогенным добавлением продукта нарушенного гена. Это помогает определить функцию гена. Метод, описанный ранее включает в себя генерацию gtfC гена нарушенных Streptococcus мутанов штамма. Здесь описан нетребовательный метод для очистки генного продукта gtfC от недавно сгенерированного штамма S. mutans после нарушения гена. Она включает в себя добавление последовательность полихиститидина кодирования на 3 "конец гена интереса, что позволяет простой очистки гена продукта с использованием иммобилизованных хроматографии сродства металла. Для генетической модификации этого метода не требуется никаких ферментативных реакций, кроме ПЦР. Восстановление генного продукта путем экзогенного добавления после нарушения гена является эффективным методом определения функции гена, который также может быть адаптирован к различным видам.
Введение
Анализ функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа с штаммами, в которых ген интереса был нарушен. Как только ген-нарушенный напряжение произведено, экзогенное добавление продукта гена позволяет функциональное восстановление.
Наиболее распространенным методом получения очищенных генных продуктов, необходимых для последующего восстановления анализов является выполнение гетерологического выражения в Escherichia coli1. Однако, выражение мембранных белков или белков высокой молекулярной массы часто трудно использовать эту систему1. В этих слу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение S. mutans sgtfC, в котором вся область кодирования гена gtfC заменяется spcr, должна быть завершена до выполнения этих протоколов. Обратитесь к опубликованной статье для получения подробной информации о поколении5.
1. Дизайн Праймера
-
Подготовка грунтовки для строительства S. mutans Его-gtfC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров, используемые в этом протоколе, отображаются в таблице 1. Двухступенчатый метод фьюжн ПЦР для генерации S. mutans
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 3 показан размер каждого ампромтона от первого ПЦР(рисунок 3A)и второго ПЦР(рисунок 3B). Размер каждого амблона соответствовал прогнозируемому размеру, как описано в таблице 1. На рисунке 4A показаны колонии S. mutans, преобразованные со вторым продуктом ПЦР и покрытые на агарных пластинах BHI, содержащих спектромицин. Продукция колон.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Конструкция грунтовок является наиболее важным шагом в протоколе. Последовательности gtfC-обратнойи spcr-forwardпраймеры были автоматически определены на основе последовательностей как 3 "конец области gtfC и 5" конец области spcr. Каждый праймер включает в себя 24 дополнительных баз, которые кодируют gs linker и его-тег-кодирования последовательности в их 5 'регионов. Нарушения местных регулятивных последовательностей, расположенных в восходящих фланговых региона.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) (гранты 16K15860 и 19K10471 до Т. М., 17K12032 до М. И., и 18K09926 н. Х.) и SECOM Научно-технический фонд (SECOM) (грант No 2018.09.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | Для электрофореза в агарозном геле |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Система анаэробных культур |
| Anti-His-Tag моноклональное антитело | MBL | D291-7 | HRP-конъюгированный |
| набор для анализа белка BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Измерение концентрации белка |
| Мозговой инфузионный бульон | Becton, Dickinson | 237500 | Бактериальная питательная среда |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | Для окрашивания биопленки |
| Центробежная ультрафильтрационная установка | Sartorius | VS2032 | Замена буфера и концентрация белка |
| Центрифуга | Kubota | 7780II | |
| Хроматографическая колонка | Bio-Rad | 7321010 | Для IMAC |
| Диализный мембранный зажим | марки Fisher | 21-153-100 | |
| Диализная трубка | как одно целое | 2-316-06 | |
| ДНК-полимераза | Takara | R045A | Высокоточная ДНК-полимераза |
| Секвенирование ДНК | Eurofins Genomics | ||
| ECL субстрат | Bio-Rad | 170-5060 | Для вестерн-блоттинга |
| ЭДТА (0,5 М pH 8,0) | Wako | 311-90075 | Препарат буфера Tris-EDTA |
| Электропорационная кювета | Bio-Rad | 1652086 | зазор 0,2 см |
| Электропоратор | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr раствор | Nippon Gene | 315-90051 | Для электрофореза в агарозном геле |
| Гелевый резак | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Гель Набор для экстракции | Nippon Genetics | FG-91202 | Экстракция ДНК из агарозного геля |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | Для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Связывающий буфер и препарат элюирующего буфера |
| Инкубатор | Nippon Medical & Химические инструменты | EZ-022 | Настройка температуры: 4 °°; C |
| Инкубатор | Nippon Medical & Химические инструменты | LH-100-RDS | Настройка температуры: 37 °°; C |
| Мембранный фильтр | Merck Millipore | JGWP04700 | 0,2 &; m диаметр |
| Микроцентрифуга | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Приготовление связывающего буфера и элюирующего буфера |
| 2PO4· 2H2O | Wako | 192-02815 | Приготовление связывающего буфера и элюирующего буфера |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Приготовление связывающего буфера и элюирующего буфера |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Осаждение сульфата аммония |
| Ni-заряженной смолой | Bio-Rad | 1560133 | Для IMAC |
| ПЦР-праймеры | Eurofins Genomics | Индивидуальный заказ | |
| Стандарт белка | Bio-Rad | 161-0381 | Для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга |
| Фильтрующий аппарат для фильтрации растворителей | Как один | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Антибиотики; использование при 100 мк; г/мл |
| Стерильный шприцевой фильтр | Merckmillipore | SLGV004SL | 0,22 &; m diameter |
| Streptococus mutans Δ gtfC | Stock штамм в лаборатории. | gtfC заменен на штамм spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock штамм в лаборатории. | S. mutans ATCC 700610, Дикий тип штамм | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | Для развития биопленки |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | Для электрофореза в агарозном геле |
| Термоамплификатор | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA буферный препарат |
Ссылки
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional an....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
