यहाँ, हम लाइव-सेल इमेजिंग जो एक गैर विषैले माइक्रोस्कोपी विधि है कि शोधकर्ताओं mitosis और आयसिस के दौरान विखंडन खमीर कोशिकाओं रहने में प्रोटीन व्यवहार और परमाणु गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देता है मौजूद है.
लाइव-सेल इमेजिंग एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है जिसका उपयोग जीवित कोशिकाओं में कोशिका और प्रोटीन गतिशीलता की जांच करने के लिए किया जाता है। इस इमेजिंग विधि विषाक्त नहीं है, आम तौर पर सेल शरीर क्रिया विज्ञान के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, और कम से कम प्रयोगात्मक हैंडलिंग की आवश्यकता है. तकनीकी हस्तक्षेप के निम्न स्तर शोधकर्ताओं mitosis के कई चक्रों में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए और शुरू से अंत तक आयतासन का निरीक्षण करने के लिए सक्षम. ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) जैसे फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करना, शोधकर्ताओं ने विभिन्न कारकों जिसका कार्य प्रतिलेखन, डीएनए प्रतिकृति, सामंजस्य, और अलगाव जैसी प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं विश्लेषण कर सकते हैं. फिजी (एक नि: शुल्क, अनुकूलित ImageJ संस्करण) का उपयोग कर डेटा विश्लेषण के साथ युग्मित, लाइव सेल इमेजिंग प्रोटीन आंदोलन, स्थानीयकरण, स्थिरता, और समय, साथ ही परमाणु गतिशीलता और गुणसूत्र अलगाव का आकलन करने के विभिन्न तरीके प्रदान करता है। हालांकि, के रूप में अन्य माइक्रोस्कोपी तरीकों के साथ मामला है, लाइव सेल इमेजिंग प्रकाश के आंतरिक गुणों द्वारा सीमित है, जो उच्च आवर्धन पर संकल्प शक्ति के लिए एक सीमा डाल दिया है, और यह भी उच्च तरंगदैर्ध्य में photobleaching या phototoxicity के प्रति संवेदनशील है आवृत्तियों. हालांकि, कुछ देखभाल के साथ, जांचकर्ताओं ध्यान से सही स्थितियों, उपभेदों, और फ्लोरोसेंट मार्करों का चयन करने के लिए mitotic और meiotic घटनाओं के उचित दृश्य के लिए अनुमति देने के द्वारा इन शारीरिक सीमाओं बाईपास कर सकते हैं.
लाइव सेल माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं विखंडन खमीर कोशिकाओं को मारने के बिना परमाणु गतिशीलता की जांच करने के लिए अनुमति देता है और घातक fixatives और दाग के लिए की जरूरत समाप्त. यह स्थिरता, आंदोलन, स्थानीयकरण, और फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन है कि गुणसूत्र प्रतिकृति, पुनर्संयोजन, और अलगाव के रूप में महत्वपूर्ण घटनाओं में शामिल हैं के समय का निरीक्षण करने के लिए संभव है, झिल्ली और cytoskeletal के अलावा आंदोलनों. सेल व्यवहार्यता और गैर विषैले संकेत का पता लगाने को बनाए रखने के द्वारा, वहाँ कम से कम शारीरिक घुसपैठ है. जब ठीक से प्रदर्शन किया, इस माइक्रोस्कोपी विधि confounding प्रभाव है कि विस्तारित तकनीकी हैंडलिंग से या नकली रासायनिक प्रतिक्रिया से उत्पन्न कम कर सकते हैं. इसके अलावा, एक प्रयोग के दौरान, शोधकर्ताओं विखंडन खमीर पोषण और तनाव राज्यों के उचित अवलोकन कर सकते हैं, proliferative दक्षता, और apoptotic स्थिति है कि अनुचित इमेजिंग पैरामीटर या असामान्य सेल शरीर क्रिया विज्ञान 1 संकेत ,2,3.
Mitosis और अर्धसूत्री विभाजन परमाणु और सेलुलर विभाजन की विशेषता है. अर्धसूत्री विज्ञान में, मिटोसिस के विपरीत, आनुवंशिक सामग्री आधी हो जाती है क्योंकि मूल कोशिकाएं बेटी कोशिकाओं को जन्म देतीहैं 4। क्योंकि लाइव सेल इमेजिंग स्थानिक संबंध के अलावा एक लौकिक आयाम प्रदान करता है, कोशिकाओं की बड़ी संख्या वास्तविक समय में जांच की जा सकती है. लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी ने शोधकर्ताओं को हिटोन्स5, कोहेसिन उपइकाइयों6, माइक्रोट्युब्यूल्स7, सेन्ट्रोमेर्स8, किनेटोकोरस9के घटकों के लिए फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करके परमाणु विभाजन की गतिशीलता की जांच करने में सक्षम बनाया है धुरी पोल शरीर (एसपीबी)10, और गुणसूत्र यात्री परिसर (सीपीसी)11के उन . गुणसूत्र पृथक्करण तंत्र के बाहर, लाइव-सेल इमेजिंग ने आवश्यक प्रोटीन के व्यवहार पर भी कब्जा कर लिया है, लेकिन गुणसूत्र पृथक्करण में सीधे शामिल नहीं है। इन प्रोटीनों के कार्य को माइक्रोट्युब्यूल्स12,13,14के प्रति प्रतिकृति, गुणसूत्र पुनर्संयोजन, नाभिकीय गति तथा गुणसूत्र लगाव को प्रभावित करने के लिए दर्शाया गया है . इन प्रेक्षणों ने सेलुलर घटनाओं की बेहतर समझ में योगदान दिया है जिनके कार्यात्मक घटक जैव रासायनिक या आनुवंशिक परीक्षा के लिए अनुकूल नहीं थे। माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में नए अग्रिमों के साथ, इस तरह के गरीब संकल्प, photobleaching, phototoxicity, और ध्यान केंद्रित स्थिरता के रूप में सीमाओं को कम होगा, जिससे mitotic और meiotic परमाणु गतिशीलता1के बेहतर वास्तविक समय टिप्पणियों की सुविधा, 2,3. Meiosis विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह एक टर्मिनल भेदभाव मार्ग है कि समय के करीब ध्यान देने की आवश्यकता है.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य mitosis और meiosis में वास्तविक समय विखंडन खमीर परमाणु गतिशीलता की जांच के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि पेश करने के लिए है. यह पूरा करने के लिए, यह कोशिकाओं है कि पर्यावरण तनाव के संपर्क में नहीं किया गया है का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, agarose पैड है कि लंबे समय तक इमेजिंग का सामना कर सकते हैं तैयार करते हैं, और घनत्व है कि एकल सेल गतिशीलता के दृश्य की सुविधा पर कोशिकाओं माउंट. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन है कि परमाणु गतिकी के लिए उपयोगी मार्करों के रूप में सेवा ले कोशिकाओं का उपयोग करता है (Hht1-mRFP या Hht1-GFP), गुणसूत्र अलगाव (Sad1-DsRed), cytoskeleton गतिशीलता (Atb2-mRFP), प्रतिलेखन G1/S (Tos4-GFP) में सक्रियण, और अर्धासन में सामंजस्य स्थिरता (Rec8-GFP). इस विधि में अतिरिक्त परमाणु और साइटोसोलिक मार्कर (तालिका I) का भी परिचय दिया गया है, जिनका उपयोग विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में प्रश्नों का समाधान करने के लिए विभिन्न संयोजनों में किया जा सकता है। इसके अलावा, बुनियादी फिजी उपकरण शोधकर्ताओं लाइव सेल छवियों की प्रक्रिया और डेटा के विभिन्न प्रकार का विश्लेषण करने में मदद करने के लिए चित्रित कर रहे हैं। इस दृष्टिकोण की ताकत प्रोटीन गतिशीलता के वास्तविक समय टिप्पणियों के उपयोग से उपजी है, समय, और स्थिरता प्रक्रियाओं है कि mitosis और meiosis के उचित निष्पादन के लिए अभिन्न हैं का वर्णन करने के लिए.
mitosis और अर्धसूत्री विज्ञान के दौरान लाइव सेल इमेजिंग डेटा अधिग्रहण के दौरान विखंडन खमीर शरीर क्रिया विज्ञान को काफी हद तक बाधित किए बिना परमाणु गतिशीलता की जांच करने का अवसर प्रदान करता है। हालांकि, सावधानी सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को पर्यावरण तनाव से मुक्त वांछित घनत्व के लिए विकसित किया जाना चाहिए; और meiosis के लिए, कि कोशिकाओं टर्मिनल भेदभाव के समय के दौरान छवि रहे हैं और बहुत जल्दी या देर से नहीं. अतिरिक्त सेलुलर भीड़, भुखमरी, और अनुचित विकास तापमान आम कारक है कि अपरिवर्तनीय टिप्पणियों के लिए योगदान कर रहे हैं. इसके अलावा, तनाव निर्माण के दौरान, यह परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट टैग लक्ष्य जीन के कार्यों के साथ हस्तक्षेप नहीं करते हैं और न ही समग्र सेल फिटनेस को प्रभावित करते हैं। बारीकी से फ्लोरोसेंट मार्करों ले जाने उपभेदों के phenotypes निरीक्षण करने में विफलता समान जीनोटाइप भर में असंगत और अतुलनीय परिणाम में परिणाम हो सकता है.
हालांकि माइक्रोस्कोप agarose पैड इकट्ठा करने के लिए सरल कर रहे हैं, वे भी मूल्यवान इमेजिंग डेटा प्राप्त करने में एक बाधा पैदा कर सकता है. agarose पैड बनाना एक दूसरे के समानांतर तीन माइक्रोस्कोप स्लाइड रखने के रूप में सरल है, बीच स्लाइड पर पिघला हुआ agarose वितरण, और एक स्लाइड है कि अन्य स्लाइड के ऊपर transverses डाल. यह उपयोगी है, तथापि, एक स्लाइड निर्माता उपकरण है कि चौड़ाई संशोधनों के लिए प्रतिरोधी, स्थिति विशेष agarose पैड का निर्माण करने के लिए अनुमति देता है इकट्ठा करने के लिए. पैड चौड़ाई लचीलापन देता है कि एक सरल स्लाइड निर्माता एक मंच (पिपेट युक्तियाँ धारक या बेंच), दो माइक्रोस्कोप स्लाइड, और प्रयोगशाला टेप पैड चौड़ाई समायोजन तंत्र के रूप में अभिनय के होते हैं (चित्र 1A). सटीक पैड मोटाई इमेजिंग समय आवश्यकताओं, agarose ब्रांड, तापमान, कवरस्लिप सीलेंट, वाष्पीकरण दर, आदि पर निर्भर करेगा इस प्रकार, तकनीकी पुन: उत्पादन क्षमता बढ़ाने के लिए और लाइव-सेल इमेजिंग 1,2,3की गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए डेटा अधिग्रहण से पहले इमेजिंग प्रणाली की जांच करना महत्वपूर्ण है। पैड सतह, कठोरता, और संरचना लंबे समय तक छवि अधिग्रहण के दौरान आवश्यक हैं. Agarose कम पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट है, आसानी से ढाला जा सकता है, और उचित एकाग्रता पर, वाष्पीकरण के कारण संरचनात्मक विरूपण का सामना. इसके अलावा, agarose के साथ विखंडन खमीर मीडिया के संयोजन छवि गुणवत्ता समझौता नहीं करता है और कई mitoses और अर्धासन चक्र की विस्तारित अवलोकन के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए किसी भी हवा के बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। Agarose पैड के अंदर और नमूने के भीतर, हवा जेब समय के साथ विस्तार, सेल स्थानांतरण और फोकल विमानों को बाधित करने के कारण. लेकिन कोशिकाओं कुशलता से कवरस्लिप रोटेशन द्वारा अलग फैल रहे हैं, शोधकर्ताओं ने कई पीढ़ियों और परमाणु संलयन से sorulation के लिए meiotic घटनाओं भर में माइटोटिक प्रक्रियाओं का पालन कर सकते हैं. बनाने और इमेजिंग प्रयोगों के लिए सही पैड का चयन मास्टर करने के लिए समय लगता है, लेकिन एक बार हासिल की, अत्यधिक जानकारीपूर्ण माइक्रोस्कोप टिप्पणियों के लिए योगदान कर सकते हैं.
के रूप में अन्य तरीकों के साथ मामला है, लाइव सेल माइक्रोस्कोपी तकनीकी सीमाओं से मुक्त नहीं है. फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग उन प्रयोगों के लिए सीमाओं का परिचय देता है जो अध्ययन किए जा सकने वाले दायरे को सीमित करते हैं। फोटो ब्लीचिंग और फोटो-विषाक्तता लंबे समय तक छवि अधिग्रहण की विशिष्ट समस्याएं हैं। वे भी लंबे समय या बहुत बार के लिए कम तरंगदैर्ध्य के लिए कोशिकाओं को उजागर नहीं द्वारा प्रतिक्रिया की जा सकती है. GFP, CFP, YFP, mRFP, और DsRed, ठेठ फ्लोरोसेंट प्रोटीन विखंडन खमीर लाइव सेल इमेजिंग में इस्तेमाल शामिल प्रयोगों के लिए, यह 5-15% उत्तेजना प्रकाश और नियमित प्रयोगों के लिए 100-500 एमएस जोखिम समय को रोजगार के लिए आम है. तथापि, अनुसंधानकर्ता की विशिष्ट प्रयोग आवश्यकताओं के अनुसार ये पैरामीटर परिवर्तित होते हैं। इसके अलावा, z-स्टैक एक 60x उद्देश्य का उपयोग कर 0.5 डिग्री सेल्सियस रिक्ति के साथ 9-13 वर्गों के शामिल एक विखंडन खमीर सेल की मोटाई को हल करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट मार्करों उचित विनियमन या लक्ष्य प्रोटीन के समारोह को बाधित नहीं करते हैं या नकली phenotypes उत्पन्न करते हैं. इस प्रकार, यह एक ही लक्ष्य जीन के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट और आत्मीयता टैग युक्त उपभेदों का निर्माण करने के लिए विभिन्न साधनों से टिप्पणियों की पुष्टि करने के लिए सलाह दी जाती है. इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना शोधकर्ताओं की जिम्मेदारी है कि प्रयोगात्मक पैरामीटरों को प्रयोगों में पुनरुत्पादित किया जा सकता है और यह कि एकत्र किए गए डेटा डाउनस्ट्रीम विश्लेषण1,3के लिए उपयुक्त हैं। कोई भी प्रौद्योगिकी सावधानीपूर्वक प्रेक्षण और फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने में रैखिकता की कठोर परीक्षा द्वारा प्रयोगात्मक प्रणालियों को सावधानीपूर्वक मान्य करने के समय-परीक्षण अभ्यास को बदल नहीं सकती है।
अंत में, यह प्रारूपों है कि कच्चे छवियों को संशोधित नहीं करते में माइक्रोस्कोपी डेटा का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है. फिजी कच्चे डेटा माप का ट्रैक रखने के लिए उत्कृष्ट प्रलेखन उपकरण प्रदान करता है और शोधकर्ताओं को एक ही सत्र में विभिन्न सेल मापदंडों की जांच करने की अनुमति देता है. इन सुविधाओं, साथ ही ऑनलाइन ट्यूटोरियल और व्यापक साहित्य कवरेज के अपने धन, फिजी को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाने, विश्लेषण, और लाइव सेल इमेजिंग डेटा है कि mitosis और meiosis में विखंडन खमीर के परमाणु गतिशीलता का वर्णन पेश.
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस पांडुलिपि की तैयारी एक और अधिक सुखद प्रयास करने के लिए नतालिया ला Fourcade और सोम LaFerte शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. Forsburg लैब जो अपनी अंतर्दृष्टि, प्रयोग विचारों, और नैतिक समर्थन के साथ इस काम के पूरा होने में योगदान के सदस्यों के लिए धन्यवाद. इस परियोजना NIGMS R35 GM118109 द्वारा SLF के लिए समर्थित किया गया था.
60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
Adenine | Sigma | A-8751 | |
Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
Biotin | Sigma | B-4501 | |
Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
Citric acid | Sigma | C-0759 | |
Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
Cover slip | VWR | 16004-302 | |
CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
Histidine | Sigma | H8125-100g | |
Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
Incubator | Shell lab | #3015 | |
Inositol | Sigma | I-5125 | |
Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
Leucine | Sigma | L8912-100g | |
Lysine | Sigma | L5626-500g | |
Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
Vaseline | Equaline | F79658 | |
yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |