Her presenterer vi Live-celle Imaging som er en ikke-giftig mikroskopi metode som gjør det mulig for forskere å studere protein atferd og kjernefysiske dynamikk i levende fisjon gjærceller under mitose og meiose.
Live-celle Imaging er en mikroskopi teknikk som brukes til å undersøke celle og protein dynamikk i levende celler. Dette tenkelig metoden er ikke giftig, vanligvis ikke forstyrrer celle fysiologi, og krever minimal eksperimentell håndtering. De lave nivåene av teknisk interferens gjør det mulig for forskere å studere celler på tvers av flere sykluser med mitose og observere meiose fra begynnelse til slutt. Ved hjelp av fluorescerende koder som grønn fluorescerende protein (GFP) og røde fluorescerende protein (RFP), kan forskerne analysere ulike faktorer som funksjoner er viktig for prosesser som transkripsjon, DNA-replikering, samhold, og segregering. Sammen med dataanalyse ved hjelp av Fiji (en gratis, optimalisert ImageJ versjon), tilbyr live-celle Imaging ulike måter å vurdere protein bevegelse, lokalisering, stabilitet og timing, samt kjernefysiske dynamikk og kromosom segregering. Men som tilfellet er med andre mikroskopi metoder, er live-celle Imaging begrenset av den iboende egenskapene til lys, som satte en grense for oppløsnings kraft ved høye forstørrelser, og er også følsom for photobleaching eller Phototoksisitet ved høy bølgelengde Frekvenser. Men med litt omsorg, etterforskere kan omgå disse fysiske begrensningene ved nøye å velge riktig forhold, stammer, og fluorescerende markører for å muliggjøre den aktuelle visualisering av mitotisk og meiotic hendelser.
Live-celle mikroskopi tillater forskere å undersøke kjernefysiske dynamikk uten å drepe fisjon gjærceller og eliminerer behovet for dødelige fiksativene og flekker. Det er mulig å observere stabilitet, bevegelse, lokalisering og timing av fluorescensmerkete merkede proteiner som er involvert i viktige hendelser som kromosom replikering, rekombinasjon, og segregering, i tillegg til membranen og cytoskjelettkomponenter Bevegelser. Ved å opprettholde celle levedyktighet og ikke-giftig signal deteksjon, det er minimal fysiologisk inntrenging. Når den utføres riktig, kan denne mikroskopi metoden redusere forvirrende effekter som oppstår fra den utvidede tekniske håndteringen eller fra falsk kjemisk reaktivitet. Videre, under et eksperiment, kan forskerne gjøre relevante observasjoner av fisjon gjær ernæringsmessige og stress tilstander, proliferativ effektivitet, og apoptotisk status som indikerer upassende bildebehandling parametere eller unormal celle fysiologi1 ,2,3.
Mitose og meiose er preget av kjernefysiske og cellulære divisjon. I meiose, i motsetning til mitose, er genetisk innhold halvert som overordnede celler gir opphav til datteren celler4. Ettersom sann tids avbildning gir en temporal dimensjon i tillegg til den romlige relasjonen, kan et stort antall celler undersøkes i sanntid. Live-Cell mikroskopi har gjort det mulig for forskere å undersøke dynamikken i kjernefysisk divisjon ved hjelp av fluorescerende koder for histoner5, cohesin under enheter6, mikrotubuli7, centromeres8, kinetochores9, komponenter i spindel Pol kroppen (SPB)10, og de av kromosom passasjer kompleks (CPC)11. Utenfor kromosom raseskille apparat, har Live-celle Imaging også fanget atferden til proteiner nødvendig, men ikke direkte involvert i kromosom segregering. Funksjonen av disse proteinene har vist å påvirke replikering, kromosom rekombinasjon, kjernefysisk bevegelse, og kromosom vedlegg til mikrotubuli12,13,14. Disse observasjonene har bidratt til en bedre forståelse av cellulære hendelser hvis funksjonelle komponenter ikke var mottagelig for biokjemiske eller genetisk undersøkelse. Med nye fremskritt innen mikroskopi teknologi, vil begrensninger som dårlig oppløsning, photobleaching, Phototoksisitet og fokus stabilitet minske, og dermed tilrettelegge for bedre sann tids observasjoner av mitotisk og meiotic kjernefysiske dynamikk1, 2,3. Meiose er spesielt utfordrende som det er en Terminal differensiering vei som krever nøye med timing.
Målet med denne protokollen er å presentere en relativt enkel metode for å undersøke sanntids fisjon gjær kjernefysiske dynamikk i mitose og meiose. For å oppnå dette, er det nødvendig å bruke celler som ikke har vært utsatt for miljømessige stress, forberede agarose pads som tåler langvarig bildebehandling, og montere celler ved tetthet som letter visualisering av enkelt celle dynamikk. Videre gjør denne protokollen bruk av celler som frakter fluorescensmerkete merkede proteiner som fungerer som nyttige markører for kjernefysisk Kinetics (Hht1-mRFP eller Hht1-GFP), kromosom segregering (Sad1-DsRed), cytoskeleton dynamikk (Atb2-mRFP), transcriptional aktivering i G1/S (Tos4-GFP), og samhold stabilitet i meiose (Rec8-GFP). Denne metoden introduserer også flere kjernefysiske og cytosolic markører (tabell I) som kan brukes i ulike kombinasjoner for å løse spørsmål om spesifikke cellulære prosesser. Videre er grunnleggende Fiji verktøy kjennetegnet for å hjelpe forskere behandle Live-celle bilder og analysere ulike typer data. Styrken i denne tilnærmingen stammer fra bruk av sanntids observasjoner av protein dynamikk, timing, og stabilitet for å beskrive prosesser som er integrert for riktig utførelse av mitose og meiose.
Live-celle Imaging under mitose og meiose gir mulighet til å undersøke kjernefysiske dynamikk uten vesentlig forstyrre fisjon gjær fysiologi under datainnhenting. Det må imidlertid utvises forsiktighet for å sikre at cellene vokser til den ønskede tettheten uten miljøbelastninger. og for meiose, at cellene er avbildet i løpet av tidspunktet for Terminal differensiering og ikke for tidlig eller sent. Overflødig cellulær trengsel, sult og upassende vekst temperaturer er vanlige faktorer som bidrar til ved uforklarlige observasjoner. I tillegg, under belastning konstruksjon, er det avgjørende å teste at fluorescerende koder ikke forstyrrer funksjonene til målet gener eller innvirkning generelle celle fitness. Unnlatelse av å undersøke nøye fenotyper av stammer som bærer fluorescerende markører kan resultere i inkonsekvente og uforlignelige resultater på tvers av lignende genotyper.
Selv om mikroskop agarose pads er enkle å montere, kan de også utgjøre et hinder i å skaffe verdifulle bildedata. Opprette agarose pads er så enkelt som å plassere tre mikroskop lysbilder parallelt med hverandre, dosering smeltet agarose på midten lysbildet, og sette et lysbilde som Transverses toppen av de andre lysbildene. Det er nyttig, men å sette sammen en Slide-Maker apparat som gjør det mulig for bredde modifikasjoner for å produsere resistente, situasjon-spesifikke agarose pads. En enkel Slide-Maker som gir puten bredde fleksibilitet består av en plattform (pipette tips holderen eller benken), to mikroskop lysbilder, og Lab tape fungerer som puten-bredde justering mekanisme (figur 1a). Eksakt pad tykkelse vil avhenge Imaging tid krav, agarose merkevare, temperatur, dekkglass tetningsmasse, fordampning rate, etc. Derfor er det viktig å kalibrere avbildnings systemet før datainnhenting for å øke teknisk reproduserbarhet og for å forbedre kvaliteten på Live-Cell Imaging1,2,3. Pad overflate, stivhet, og sammensetning er avgjørende ved langvarig bildeoppkjøp. Agarose har lav bakgrunn fluorescens, kan lett formes, og ved riktig konsentrasjon, tåler strukturelle deformasjon på grunn av fordampning. Videre kombinerer fisjon gjær medier med agarose ikke kompromiss bildekvalitet og gir mulighet for utvidet observasjon av flere mitoses og meiose sykluser. Det er også viktig å unngå eventuelle luftbobler for time-lapse mikroskopi. I agarose pads og i prøven utvides Luftlommene over tid, noe som fører til celle forskyvning og forstyrrer fokal plan. Forutsatt celler er effektivt spres fra hverandre ved dekkglass rotasjon, kan forskerne følge mitotisk prosesser over flere generasjoner og meiotic hendelser fra kjernefysisk fusjon til sporulation. Making og velge riktig pad for Imaging eksperimenter tar tid å mestre, men når oppnådd, kan bidra til svært informative mikroskop observasjoner.
Som tilfellet er med andre metoder, er ikke direkte celle mikroskopi uten tekniske begrensninger. Bruken av fluorescensmerkete proteiner introduserer grenser for eksperimenter som begrenser omfanget av hva som kan bli studert. Foto-bleking og foto-toksisitet er problemer typisk for langvarig bildeoppkjøp. De kan motarbeides ved å ikke utsette celler for korte bølgelengder for lenge eller for ofte. For eksperimenter som involverer GFP, CFP, YFP, mRFP, og DsRed, typiske fluorescerende proteiner som brukes i fisjon gjær Live-celle Imaging, er det vanlig å ansette 5-15% eksitasjon lys og 100-500 MS eksponeringstid for rutinemessige eksperimenter. Disse parametrene endres imidlertid i henhold til de spesifikke eksperiment kravene til forskeren. I tillegg z-stabler består av 9-13 seksjoner med 0,5 μm avstand ved hjelp av en 60x mål er nok til å løse tykkelsen på en fisjon gjær celle. Videre er det viktig å bekrefte at fluorescerende markører ikke forstyrrer riktig regulering eller funksjon av mål proteiner eller genererer falske fenotyper. Derfor er det tilrådelig å konstruere stammer som inneholder ulike fluorescerende og affinitet koder for samme mål genet å bekrefte observasjoner av ulike virkemidler. Videre er det ansvaret til forskere for å sikre at eksperimentelle parametre kan reproduseres på tvers av eksperimenter og at de innsamlede dataene er egnet for nedstrøms analyse1,3. Ingen teknologi kan erstatte tid-testet praksis av omhyggelig validere eksperimentelle systemer ved nøye observasjon og grundig undersøkelse av linearitet i å oppdage fluorescerende signaler.
Til slutt er det avgjørende å analysere mikroskopi data i formater som ikke endrer RAW-bilder. Fiji gir utmerket dokumentasjon verktøy for å holde styr på rådata målinger og gjør forskerne til å undersøke ulike celle parametre i en enkelt økt. Disse funksjonene, så vel som sin rikdom av online opplæringsprogrammer og omfattende litteratur dekning, gjør Fiji et viktig verktøy for å måle, analysere og presentere Live Cell Imaging data som beskriver kjernefysiske dynamikken i fisjon gjær i mitose og meiose.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Natalia la Fourcade og Mon LaFerte for å gjøre utarbeidelsen av dette manuskriptet en morsommere oppgave. Takket være medlemmer av Forsburg Lab som bidro til fullføringen av dette arbeidet med sin innsikt, eksperiment ideer, og moralsk støtte. Dette prosjektet ble støttet av NIGMS R35 GM118109 til SLF.
60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
Adenine | Sigma | A-8751 | |
Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
Biotin | Sigma | B-4501 | |
Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
Citric acid | Sigma | C-0759 | |
Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
Cover slip | VWR | 16004-302 | |
CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
Histidine | Sigma | H8125-100g | |
Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
Incubator | Shell lab | #3015 | |
Inositol | Sigma | I-5125 | |
Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
Leucine | Sigma | L8912-100g | |
Lysine | Sigma | L5626-500g | |
Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
Vaseline | Equaline | F79658 | |
yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |