I Vesiculo syntes av peptid membran prekursorer för autonoma vesikler tillväxt
Summary
Presenteras här är protokoll för skapandet av peptid-baserade små små blåsor som kan växa. För att underlätta i vesikulobullösa produktion av membran peptid, dessa blåsor är utrustade med en transkription-översättningssystem och peptid-kodning plasmid.
Abstract
Compartmentalization av biokemiska reaktioner är en central aspekt av syntetiska celler. För detta ändamål, peptid-baserade reaktions utrymmen fungera som ett attraktivt alternativ till liposomer eller fettsyrabaserade vesikler. Externt eller inom vesiklarna, peptider kan lätt uttryckas och förenkla syntesen av membran prekursorer. Förutsatt att här är ett protokoll för skapandet av blåsor med diametrar på ~ 200 nm baserat på den amfifila elastin-liknande polypeptider (ELP) utnyttjar uttorkning-rehydrering från glaspärlor. Också presenteras är protokoll för bakteriell ELP uttryck och rening via omvänd temperatur Cykling, liksom deras kovalenta funktionalisering med fluorescerande färgämnen. Dessutom beskriver detta betänkande ett protokoll för att möjliggöra transkription av RNA aptamer dbroccoli inuti ELP blåsor som ett mindre komplext exempel för en biokemisk reaktion. Slutligen ges ett protokoll, som gör att vesikulobullösa uttryck för fluorescerande proteiner och membran peptid, medan syntesen av de senare resulterar i vesikler tillväxt.
Introduction
Skapandet av syntetiska levande cellulära system är oftast närmade sig från två olika riktningar. I uppifrån-och-ner-metoden reduceras genomet hos en bakterie till dess viktiga komponenter, vilket i slutändan leder till en minimal cell. I bottom-up-metoden är konstgjorda celler monterade de Novo från molekylära komponenter eller cellulära delsystem, som måste integreras funktionellt i ett konsekvent cell-liknande system.
I de Novo-metoden uppnås vanligen uppdelning av de nödvändiga biokemiska komponenterna med hjälp av membran tillverkade av fosfolipider eller fettsyror1,2,3,4. Detta beror på att “moderna” cellmembran består huvudsakligen av fosfolipider, medan fettsyror betraktas rimliga kandidater av prebiotiska membran kapslingar5,6. För bildandet av nya membran eller för att underlätta membran tillväxt, amfifila byggstenar måste tillhandahållas från utsidan7 eller helst genom produktion i ett membranös fack med hjälp av motsvarande anabola processer4 ,8.
Medan lipid syntes är en relativt komplex metabolisk process, peptider kan produceras ganska lätt med hjälp av cell-Free genuttryck reaktioner9,10. Därav, peptid membran bildas av amfifila peptider utgör ett intressant alternativ till lipid membran som kapslingar för konstgjorda cell härmar som kan växa11.
Amphiphilic elastin-liknande di-block sampolymerer (ELPs) är en attraktiv klass av peptider, som kan fungera som byggstenen för sådana membran12. Den grundläggande aminosyran sekvens motiv av ELPs är (gagvp)n, där “a” kan vara någon aminosyra utom prolin och “n” är antalet motiv upprepas13,14,15,16,17 . ELPs har skapats med ett hydrofobiskt block som huvudsakligen innehåller fenylalanin för a och ett hydrofila block, huvudsakligen sammansatt av glutaminsyra11. Beroende på a-och lösnings parametrar, såsom pH-och saltkoncentration, uppvisar ELPs en så kallad omvänd temperatur övergång vid temperatur Tt, där peptiderna genomgår en helt reversibel fasövergång från en hydrofilt till hydrofoba Statligt. Syntesen av peptiderna kan enkelt implementeras inuti blåsor med hjälp av “TX-TL” bakteriecell extrakt11,18,19,20,21, som ger alla nödvändiga komponenter för kopplade transkription och översättnings reaktioner.
TX-TL-systemet kapslades ihop, med DNA-mallen kodning av ELPs i ELP blåsor utnyttja uttorkning-rehydrering från glaspärlor som en solid stöd. Bildandet av vesikler sker genom rehydrering av de torkade peptiderna från pärlytan11. Andra metoder22 för vesikelbildning kan användas, som potentiellt visar lägre polydispersitet och större vesikler storlekar (t. ex., Electro-formation, emulsion fas överföring, eller mikrofluidics-baserade metoder). För att testa inkapslings metodens genomförbarhet kan transkription av den fluorogena aptamer dBroccoli23 alternativt användas11, vilket är mindre komplext än genuttryck med TX-TL-systemet.
På grund av uttrycket av membran byggstenarna i vesikulobullösa och deras senare inkorporering i membranet börjar vesiklarna att växa11. Membran inkorporering av ELPs kan påvisas genom en FRET analys. För detta ändamål är de ELPs som används för bildandet av den initiala vesikeln befolkningen konjugeras med fluorescerande färgämnen i lika delar som utgör en FRET par. Vid uttryck av icke-märkta ELPs i vesikulobullösa och deras införlivande i membranet, den märkta ELPs i membranet späds ut och därmed bandet signalen minskar11. Som en mångsidig och gemensam metod för konjugering, koppar katalyseras azid-alkyne cykloaddition används. Med hjälp av en stabiliserande ligand såsom tris (benzyltriazolylmetyl)-Amin, kan reaktionen utföras i en vattenlösning vid ett Fysiologiskt pH utan hydrolys av reaktanter11, vilket är lämpligt för konjugation reaktioner med peptider.
I följande protokoll presenteras en detaljerad beskrivning av förberedelserna för odling av ELP-baserade peptidosomer. Uttrycket av peptider och vesikelbildning med hjälp av glaspärlor metoden beskrivs. Vidare beskrivs hur man genomför transkription av den fluorogena dBroccoli aptamer och transkription-översättning reaktion för proteinuttryck inuti ELP blåsor. Slutligen, förutsatt är ett förfarande för konjugering av ELPs med fluoroforer, som kan användas för att bevisa vesikler tillväxt genom en FRET analys11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Film rehydrering är ett vanligt förfarande för skapandet av små små blåsor. Den huvudsakliga källan till misslyckande är felhantering av de material som används i förfarandet.
Inledningsvis, den ELPs produceras av E. coli celler. Avkastningen efter ELP rening kan variera avsevärt beroende på hur noggrant protokollet genomförs under dess avgörande steg. Dessa är den inversa temperatur cykling (ITC) steg …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner tacksamt finansiellt stöd genom DFG TRR 235 (livets uppkomst, Project p15), Europeiska forskningsrådet (Grant Agreement nr 694410 AEDNA), och TUM internationella forskarskolan för vetenskap och teknik IGSSE (projekt nr 9,05) . Vi tackar E. Falgenhauer för hennes hjälp med provberedning. Vi tackar A. Dupin och M. Schwarz-Schilling för deras hjälp med TX-TL-systemet och nyttiga diskussioner. Vi tackar N. B. Holland för nyttiga diskussioner.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -. S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
