Pan-myeloida differentiering av humant navelsträngsblod härrör CD34+ hematopoietiska Stem och progenitorceller
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för immunophenotypic karakterisering och cytokin inducerad differentiering av navelsträngsblod härrör CD34+ hematopoietiska stamceller och stamceller till de fyra myeloida linjerna. Tillämpningarna av detta protokoll omfattar utredningar om effekten av myeloida sjukdoms mutationer eller små molekyler på myeloisk differentiering av CD34+ -cellerna.
Abstract
Ex vivo differentiering av mänskliga hematopoietiska stamceller är en allmänt använd modell för att studera hematopoies. Det protokoll som beskrivs här är för cytokin inducerad differentiering av CD34+ hematopoietiska stamceller och stamceller till de fyra myeloida Lineage celler. CD34+ celler är isolerade från mänskliga navelsträngsblod och co-odlade med MS-5 stromaceller i närvaro av cytokiner. Immunophenotypic karakterisering av stammen och progenitorceller, och de differentierade myeloida härstamning celler beskrivs. Med hjälp av detta protokoll, CD34+ celler kan inkuberas med små molekyler eller sensorik med upphov att uttrycka myeloisk sjukdom mutationer att undersöka deras inverkan på myeloisk differentiering.
Introduction
Normal differentiering av hematopoietiska stamceller (HSCs) är avgörande för upprätthållandet av fysiologiska nivåer av alla blod cells linjer. Under differentiering, i ett samordnat svar på extracellulära signaler inklusive tillväxtfaktorer och cytokiner, hscs först ge upphov till multipotenta stamceller (MPP) celler som har Lympho-myeloid potential1,2,3 ,4 (figur 1). MPPs ger upphov till gemensamma myeloida stamceller (CMPs) och vanliga lymfoida stamceller (CLPs) som är härstamning begränsad. CLPs differentiera till lymfoida linjer som består av B, T, och naturliga mördarceller. CMPS generera myeloida linjer genom två mer begränsade stamceller, megakaryocyter erytroid stamceller (ledamöter), och granulocyt monocyt progenitorer (GMPs). Europaparlamentets ledamöter ger upphov till megakaryocyter och erytrocyter, medan GMPs ger granulocyter och monocyter. Förutom att uppstå genom CMPS, megakaryocyter har rapporterats att också uppstå direkt från hscs eller tidiga MPPS via icke-kanoniska vägar5,6.
Hematopoietiska Stem och stamceller (HSPCs) kännetecknas av ytan markör CD34 och avsaknaden av härstamning specifika markörer (lin–). Andra ytmarkörer som vanligen används för att särskilja HSCs-och myeloida stam populationer inkluderar CD38, CD45RA och CD1232 (figur 1). HSCs och MPPs är lin–/Cd34+/CD38– respektive lin–/CD34+/CD38+. Myeloid engagerade stamfader populationer kännetecknas av närvaron eller frånvaron av CD45RA och CD123. CMPS är lin–/CD34+/CD38+/CD45RA–/cd123Lo, GMPs är lin–/CD34+/CD38+/CD45RA+/cd123Lo, och ledamöterna är lin–/CD34+ /Cd38+/Cd45ra–/cd123–.
Den totala populationen av CD34+ Stem och stamceller kan erhållas från humant navelsträngsblod (UCB), benmärg och perifert blod. CD34+ celler utgör 0,02% till 1,46% av totala mononukleära celler (mnk) i humant UCB, medan deras andel varierar mellan 0,5% och 5,3% i benmärg och är mycket lägre vid ~ 0,01% i perifert blod7,8,9 . Den proliferativa kapaciteten och differentierings potentialen hos UCB-härledda CD34+ -celler är signifikant högre än för benmärg eller perifera blodkroppar1,10, vilket ger en klar fördel för att erhålla tillräckligt material för molekylära analyser i kombination med att utföra immunophenotypic och morfologisk karakterisering av cellerna under differentiering.
Ex vivo differentiering av navelsträngsblod härrör CD34+ hspcs är en allmänt tillämpad modell för att undersöka normal hematopoies och hematopoietiska sjukdomsmekanismer. När de odlas med lämpliga cytokiner kan UCB CD34+ hspcs induceras för att differentiera längs myeloida eller lymfoida linjer11,12,13,14,15 , 16. här beskriver vi protokoll för isolering och immunophenotypic karakterisering av CD34+ hspcs från Human UCB, och för deras differentiering till myeloida Lineage celler. Detta kultur system bygger på cytokininducerad differentiering av HSPCs i närvaro av MS-5 stromaceller för att efterlikna mikromiljön i benmärgen. Kulturen villkor orsakar en första expansion av CD34+ celler, följt av deras differentiering till celler som uttrycker markörer för de fyra myeloida Lineage celler, nämligen granulocyter (CD66b), MONOCYTER (CD14), megakaryocyter (CD41), och erytrocyter (CD235a). Tillämpningar av CD34+ celldifferentiering protokollet omfattar studier om molekylära mekanismer som reglerar hematopoies, och utredningar av effekterna av myeloisk sjukdom associerade mutationer och små molekyler på självförnyelse och differentiering av HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivs här lämpar sig för ex vivo-differentiering av UCB härledda CD34+ hspcs till de fyra myeloida linjerna. Initial inkubering med en cytokin-blandning bestående av SCF, TPO, Flt3L och IL3 stimulerar CD34+ cellerna. Därefter, differentiering uppnås med en cocktail av SCF, IL3, Flt3L, EPO, och TPO. I denna mix, SCF, IL3, och Flt3L är viktiga för överlevnad och spridning av CD34+ hscs. EPO och TPO främja differentiering mot erytrocyter och megakaryocyter, re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Wendy Barrett, Rachel Caballero, och Gabriella Ruiz av Maricopa integrerat hälsosystem för de identifierade och donerade navelsträngsblod enheter, Mrinalini kala för hjälp med flödescytometri, och homosexuella skurkar och Christopher seet för och råd om myeloisk ex vivo-differentiering. Detta arbete stöddes av medel till S.S. från National Institutes of Health (R21CA170786 och R01GM127464) och American Cancer Society (det institutionella Forskningsbidraget 74-001-34-IRG). Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
