1. Programmering af den automatiserede væskehandler Opret en ny metode fra menuen Filer (Fil | Ny metode)BEMÆRK: Udfør trinnene i den angivne rækkefølge. Den kursiv skrifttype angiver tekst, der skal skrives i Biomek-softwaren. Kontakt forfatterne for at få oplysninger om pipetteringsteknikker og skabeloner. Skriv Starttrinsvariabler og deres værdier i starttrinnet som angivet i tabel 1. Angiv kolonner til selektiv spidspipetting. Klik på trinnet Global på værktøjslinjen under Kontroltrin for trin 1.3-1.7, og træk det til metoden. Brug trinnet Angiv global værdi =FirstColumn til variabel FirstColumn_Global, værdi =LastColumn til variabel LastColumn_Global, værdi =LastColumn-FirstColumn+1 til variable kolonnerog værdi =Kolonner*8 til variable brønde. Vælg trinnet Script på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv VB-scriptet som angivet i figur 2. Indstilling af diskenheder for blandinger Angiv global og løsninger. Brug trinnet Angiv globalt skal du angive de tilsvarende værdier til volumenmixvariablerne som vist i tabel 2. Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv Autosampler underforhold. Klik Thenpå trinnet Angiv globalt på værktøjslinjen under Kontroltrin under Derefter, og træk det til metoden. Ved hjælp af trinnet Angiv global skal du angive værdi =(MobilePhase*Kolonner)+10 til variabel MobilePhaseWell. Klik på trinnet Angiv globalt på værktøjslinjen under Kontroltrin under Ellers,og træk det til metoden. Control Steps Brug trinnet Angiv global værdi =0 til variabel MobilePhaseWell ved hjælp af trinnet Angiv global Konfiguration af automatiseret labwareopsætning (GLS) Klik på trinnet Præsentationseditor på værktøjslinjen under Hjælpeprogrammer. Opret et nyt deck, der svarer til deckets layout i figur 3, og mærk det som dæk 1. Klik på trinnet Automatiseret installation på værktøjslinjen under Installation og enheder, og træk det til metoden. Træk og slip labwaretyperne i dækpositionerne som angivet i tabel 3. Fyld derefter fanerne i tabellen som vist i tabel 3 og Figur 4 (Opsætning af den styrede opsætning). Opsætning af procedure for optælling af tip Klik på trinnet Definer procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navn procedure som TipCount. Klik Script på scripttrinnet på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv VB-scriptet som angivet i figur 5 (script til optælling af tip). Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Under betingelser skal du skrive TL5 = 0. Klik Thenderefter på trinnet Flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra TL5 til TR3. Klik på trinnet Flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra TL2 til TL5. Endelig skal du klikke på trinnet Flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed og trække det til metoden. Flyt labware fra BC90 til TL2. Fastlæggelse af proceduren for inkubator Klik på trinnet Definer procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navneprocedure som Inkubator. Skriv HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardværdi. Skriv NextTemp som variabelnavn og 22 som standardværdi. Skriv temp som variabelnavn og 60 som standardværdi. Klik på trinnet Udvidet flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra P11 til INHECO1. Klik på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navneprocedure som TipCount. Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 for at bruge anordningen ved position, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C af måltemperaturen. Vælg shake mens inkubering mulighed og Orbital (med uret) ryste stil. For indstillinger skal du skrive 1,00 mm fra side til side, 6,6 gange i sekundet, 1,00 mm fremad annonce baglæns og 6,6 gange i sekundet.BEMÆRK: Sørg for, at INHECO Incubator-softwaren er installeret. Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 for at bruge anordningen ved position, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C af måltemperaturen. Vælg Shake mens inkubering mulighed og Orbital (Mod uret) ryste stil. For indstillinger skal du skrive 1,00 mm fra side til side, 6,6 gange i sekundet, 1,00 mm frem og tilbage 6,6 gange i sekundet. Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Sæt hele systemet på pause i 1 s. Klik på trinnet Definer procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Navneprocedure som Inkubator. Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 for at anvende anordningen ved position, 1 for Inkuber for, =NextTemp for °C og 3 for °C måltemperatur. Definition af procedure for Orbital. Klik på trinnet Udvidet flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware fra P11 til Orbital1. Klik på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden. Vælg procedure TipCount. Klik på trinnet Enhedshandling på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Vælg Enhed OritalShaker0, Kommando TimedShake. Indtast rystehastighed 1000, Tid til at nå fuld hastighed 2, Tid til at ryste 30. Klik på trinnet Udvidet flyt Labware på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Flyt labware Orbital1 til P11. Opsætning af den første blanding Klik på trinnet Vælg tip på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden. Vælg omarranger position TL4. Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Indtast INHECO1 til brug af anordningen ved position, 1 for Inkubator for, 60 for °C og 3 for °C måltemperatur. Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trinnet Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som og 1 som Increment. Klik på trinnet Vælg tip indlæstips på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for løkketrinnet. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkketrinnet. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =FirstMix, Aspirate i kolonne 1 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkketrinnet. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =FirstMix, dispenser i kolonne =kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for løkketrinnet. Vælg Fjern tip til TR1. Opsætning af prøverne Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Type SamplePlate som betingelse. Klik Thenpå trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv =tipkolonner. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden indenfor. Vælg Greiner96RoundPS Labware Type og Prøver Position. Skriv i volumen =Sample, Aspirate i kolonne =FirstColumn og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden indenfor. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv volumen =Prøve, dispenser i kolonne = FirstColumn og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1. Når trinnet er afsluttet, skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække det til metoden. Vælg procedure kuvøse. Skriv HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardværdi. Skriv NextTemp som variabelnavn og 22 som standardværdi. Skriv temp som variabelnavn og 60 som standardværdi. Opsætning af Cysteinblokken Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trin i Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment. Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =CysteineMix, aspirat i kolonne 2 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Type i volumen = CysteineMix, dispensere i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1. Når løkken er , skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure kuvøse. Skriv HalfTime som variabelnavn og 300 som standardværdi. Skriv NextTemp som variabelnavn og 43 som standardværdi. Skriv temp som variabelnavn og 25 som standardværdi. Opsætning af det andet mix Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trin i Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment. Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke, og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv i bind =SecondMix, Aspirate i kolonne 3 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv i volumen = SecondMix, Dispenseri kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1. Når løkken er, skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure Orbital. Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Sæt hele systemet på pause i 1 s. Opsætning af Trypsin-tilføjelse Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trin i Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment. Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =Trypsin, Aspirate i kolonne 4 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden i løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv volumen =Trypsin, Dispenser i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip, aflæs på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden indenfor. Vælg Fjern tip til TR1. Når løkken er , skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure kuvøse. Skriv HalfTime som variabelnavn og 3600 som standardværdi. Skriv NextTemp som variabelnavn og 25 som standardværdi. Skriv temp som variabelnavn og 43 som standardværdi. Klik på trinnet INHECO-inkubering på værktøjslinjen under Integrationer, og træk det til metoden. Sørg for, at INHECO Incubator-softwaren er installeret. Indtast INHECO1 til brug af anordningen ved position, 1 for Inkubator for, 25 for °C og 5 for °C måltemperatur. Opsætning af dæmpning Klik på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk den til metoden i Trinnet Vælg tip. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment. Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =Dæmpning, Aspirate i kolonne 5 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv volumen =Dæmpning, Dispenser i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for Derefter. Vælg Fjern tip til TR1. Når løkken er, skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure Orbital. Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Sæt hele systemet på pause i 1 s. Klik på trinnet Afbryd midlertidigt på værktøjslinjen under Trin til installation og enhed, og træk det til metoden. Vælg Sæt hele systemet på pause, og vis denne meddelelse. Skriv meddelelsen ‘Fortsæt efter centrifugering’. Opsætning af pladen til Autosampler Klik på trinnet Hvis på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden, i trinnet Vælg tip. Skriv Autosampler som betingelse. Klik Thenderefter på trinnet Løkke på værktøjslinjen under Kontroltrin, og træk det til metoden. Skriv col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som End og 1 som Increment. Klik på trinnet Vælg tip indlæsspidser på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin under Løkke,og træk det til metoden. Vælg BC230-tip, TL6-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv i 1. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reagenspladeposition. Skriv volumen =MobilePhase, Aspirate i kolonne 6 og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv i volumen =MobilePhase, Dispensere i kolonne = kol og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden inden for Derefter. Vælg Fjern tip til TR1. Når løkken er , skal du klikke på trinnet Kør procedure på værktøjslinjen under Kontroltrin og trække den til metoden. Vælg procedure TipCount. Klik på trinnet Vælg tip indlæsser tip på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden. Vælg BC90-tip, TL5-placering og Placering af TL2-sikkerhedskopieringstip i rullemenuen. Vælg Enkelt kolonne(er), og skriv =tipkolonner. Klik på trinnet Vælg tip aspirat på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden i løkken. Vælg BCDeep96Round Labware Type og Reaktionspladeposition. Skriv i volumen =DigestTransfer, Aspirate ved kolonne =første kolonne og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip dispensere på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk det til metoden inden for løkken. Vælg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv i volumen =MobilePhase, Dispensere i kolonne =FirstColumn og række 1. Vælg en optimeret teknik fra rullemenuen teknik. Klik på trinnet Vælg tip Fjern på værktøjslinjen under Flydende håndteringstrin, og træk den til metoden i derefter. Vælg Fjern tip til TR1. Trinnet med valgte tip slutter her. Gem og navngiv metoden. 2. Klargør prøve, labware og reagenser 5 μL poolet sundt humant plasma overføres til en polypropylen, 96-Round Deep Well Plate.BEMÆRK: Se Materialetabel for reagenser og forsyninger, der anvendes i denne protokol. TPCK Behandlet Trypsin blev købt og trypsin til substrat forhold og inkubationstid blev optimeret specifikt. Hvis der anvendes en anden grad af trypsin, såsom sekvenskvalitet rekombinant trypsin, bør enzymet til substratforholdet og inkubationstiden testes og optimeres. 3. Dobbeltklik på softwareikonet. Under fanen Metode skal du vælge Hjem alle akser for at orientere og forberede den automatiserede væskehandler. Sørg for, at alle arbejdsstationssprøjter ikke indeholder synlige luftbobler. Vælg Åbn | Metode. Vælg metoden (Figur 6). Start metoden ved at klikke på Run det grønne trekantsformede Run-ikon. Hvis der skal fremstilles en autosamplerplade i slutningen af metoden, skal du angive værdien ‘true’ i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten ‘Autosampler’, og derefter klikke på OK. Hvis der ikke forberedes en autosamplerplade, skal du angive værdien ‘false’ og derefter klikke på OK. Angiv værdien ‘1’ i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten ‘firstcolumn’, og klik derefter på OK. Angiv værdien ’12’ i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten ‘lastcolumn’, og klik derefter på OK.BEMÆRK: Dette trin og trin 4.7 fortæller arbejdsstationen at udføre en fordøjelse på 12 kolonner af en 96-brønd plade, hvilket resulterer i alle brønde af pladen, der anvendes til fordøjelsen Hvis der bruges en prøveplade sammen med prøvemængder på mindst 20 μL, skal værdien ‘true’ indtastes i prompten Angiv en værdi, der skal bruges til prompten ‘SamplePlate’, og derefter klikke på OK. Hvis der ikke bruges en eksempelplade, skal du angive værdien ‘false’ og derefter klikke på OK.BEMÆRK: Hvis der ikke anvendes en prøveplade, tilsættes der 5 μL prøve til hver tilsvarende brønd på reaktionspladen. Følg vejledningen i vinduet Automatiseret Labware-opsætning, og klik på Fortsæt.BEMÆRK: Det næste vindue beskriver layoutet for den “reagensplade”, der skal udarbejdes (Figur 7, Supplerende tabel 1). Følgende bind vil blive aliquoted i hver af de 8 brønde af en enkelt kolonne i 1 ml Deep Round 96-brønd plade:Kolonne 1: 540 μL reaktionsblanding 1.Kolonne 2: 50 μL cysteinblok.Kolonne 3: 730 μL reaktionsblanding 2.Kolonne 4: 130 μL Trypsin.Kolonne 5: 130 μL dæmpningsopløsning.Kolonne 5: 1090 μL af mobil faseløsning (Hvis brugeren indtastede ‘true’ i trin 6). Klik på Næste, og i det følgende vindue beskrives det mindste volumen (20 μL), der skulle aliciteres i prøvepladen. Hvis brugeren har angivet værdien ‘false’ for den prompt, der involverer prøvepladen (trin 9), bliver brugeren bedt om at tilføje 5 μL prøve til reaktionspladen. Klik på Næste.BEMÆRK: Det næste vindue viser, at der skal placeres en tom 90 μL tipboks på det automatiske væskehåndteringsdæk. Klik på Næste igen, udlægning af den automatiserede væskebehandlers dæk som angivet og illustreret (Figur 8), herunder reagenspladen, reaktionspladen, prøvepladen, autosamplerpladen, 6 fulde 90 μL tipkasser, en tom 90 μL tipboks og en fuld 230 μL tipboks. Klik på Udfør for at starte metoden.BEMÆRK: Når du har klikket på Udfør, kan brugeren ikke nå ind i den automatiserede væskehandler. Dette vil “bryde maskinens lysgardin” og stoppe væskehåndteringen som en sikkerhedsforanstaltning. Ved fortsæt efter centrifugeringsprompten skal reaktionspladen hentes og centrifugeres i 30 minutter ved 3.000 omdrejninger i minuttet. Når centrifugeringen er fuldført, returneres reaktionspladen til den automatiserede væskebehandler til den position, den befandt sig i før centrifugering, og klik på Fortsæt.BEMÆRK: Den automatiske væskebehandler stopper igen, når metoden er færdig. Hvis brugeren har indtastet »true« for trin 6, kan autosamplerpladen fjernes fra arbejdsstationen og anbringes i autosampleren på et flydende kromatografiinstrument til analyse. 4. LC-MSMS Peptider på et højt flow HPLC bestående af et C18 2,1 mm x 100 mm, 3,5 μm søjle med en strømningshastighed på 0,25 ml/min og analyseret inline på et tredobbelt quadrupol massespektrometer.BEMÆRK: Efter peptidfordøjelseer beskrives den målrettede LC-MSMS-metode til kvantificering af peptider fra robotfremstillede prøver i detaljer1 efter en kort beskrivelse af LC-MSMS. Indstil kolonneovnstemperaturen til 40 °C. Brug buffer A (2% ACN, 98% vand, 0,1% myresyre) og buffer B (95% ACN, 5% vand, 0,1% myresyre) som de to mobile faser. Kolonnen skal kalibreres med 5% B i 5 minutter efter indlæsning. Elute peptiderne over 30 minutter med en lineær 5% til 35% gradient af buffer B. Gengør kolonnen, før den næste prøve tages i brug, ved at vaske med 98 % B i 10 minutter og derefter 5 % B i 5 minutter. Ved on-line-omdirigering skal du omstille eluent efter kolonnen til affald, før det kom ind i ionkilden ved hjælp af en tofaset koblingsventil. Behandl MRM-dataene.