Ex vivo metode til vurdering af musens reproduktive kanal spontan motilitet og en MATLAB-baseret uterus motion tracking algoritme til data analyse

Summary

Uterine sammentrækninger er vigtige for trivsel af kvinder. Men, patologisk øget kontraktilitet kan resultere i dysmenorré, især hos yngre kvinder. Her beskriver vi et simpelt ex vivo præparat, der giver mulighed for hurtig vurdering af effekten af glatte muskelafslappende midler, som kan anvendes til behandling af dysmenorré.

Abstract

Dysmenorré, eller smertefulde kramper, er det mest almindelige symptom forbundet med menstruation hos kvinder og dens sværhedsgrad kan hæmme kvinders hverdag. Her præsenterer vi en nem og billig metode, der ville være medvirkende til at teste nye lægemidler faldende uterin kontraktilitet. Denne metode udnytter den unikke evne til hele musens reproduktive kanal til at udvise spontan motilitet, når den vedligeholdes ex vivo i en Petri skål indeholdende oxygeneret Krebs buffer. Denne spontane motilitet ligner den bølge-lignende myometriale aktivitet af den menneskelige uterus, omtales som endometriale bølger. For at demonstrere effektiviteten af metoden, vi ansat en velkendt uterin afslappende lægemiddel, epinephrin. Vi viser, at den spontane motilitet af hele musens reproduktive kanal kan hurtigt og reversibelt hæmmes af 1 μM adrenalin i denne Petri skål model. Dokumentere ændringer af uterin motilitet kan nemt gøres ved hjælp af en almindelig smart telefon eller et sofistikeret digitalt kamera. Vi udviklede en MATLAB-baseret algoritme, der tillod motion tracking at kvantificere spontane uterin motilitet ændringer ved at måle hastigheden af livmoder horn bevægelser. En stor fordel ved denne ex vivo tilgang er, at den reproduktive tarmkanalen forbliver intakt i hele forsøget, bevare alle iboende intrauterin cellulære interaktioner. Den væsentligste begrænsning af denne fremgangsmåde er, at op til 10-20% af uteri ikke kan udvise spontan motilitet. Hidtil er dette den første kvantitative ex vivo -metode til vurdering af spontan uterin motilitet i en Petri skål model.

Introduction

Som et stort kvindeligt organ, livmoderen er afgørende for reproduktion og afgørende for næring af fosteret¹. Livmoderen består af tre lag: perimetrium, myometrium og endometrium. Den myometrium er den største kontraktile lag af livmoderen og spiller en central rolle i fosteret levering. Endometriet er det inderste lag foring af livmoderhulen og er afgørende for embryo implantation. Hos ikke-gravide kvinder i den fødedygtige alder, den endometriale lag er kastet månedligt i begyndelsen af menstruationscyklus. Myometrium aids i denne udgydelse proces ved at opretholde de spontane myometriale sammentrækninger er nødvendige for at rydde det nekrotiske endometriale væv fra livmoderen¹.

Desværre, øget myometrial kontraktilitet kan resultere i negative bivirkninger såsom dysmenorré, eller smertefulde menstruations kramper. Dette ses især hos unge kvinder og født Women². Men, dysmenorré er forskellig for hver kvinde og afhænger af styrken af deres myometriale sammentrækninger; stærkere sammentrækninger er ofte forbundet med følelsen af svære kramper³. Myometrial kontraktilitet kan visualiseres ved hjælp af uterin ultralyd og er ofte anerkendt som endometriale bølger. Øget frigivelse af prostaglandiner under menstruation⁴ i en livmoder, der gennemgår endometriale sløjning menes at bidrage til øget myometrial hyperkontraktilitet, hvilket resulterer i iskæmi og hypoksi af uterin musklen og dermed øget smerte³.

Svær dysmenorré kan hæmme den daglige aktivitet af nogle kvinder og 3 til 33% af kvinderne har meget svære smerter, som kan forårsage en kvinde at være sengeliggende for 1 til 3 dage hver menstruationscyklus⁵. Dysmenorré er den førende årsag til gynækologisk sygelighed i kvinder i den reproduktive alder uanset alder, nationalitet og økonomisk status⁵. Den anslåede prævalens af dysmenorré er både høj og variabel, lige fra 45% til 93% i kvinder i den reproduktive alder⁵.  Dysmenorré-associerede smerter har en effekt på det daglige liv af kvinder og kan resultere i dårlig akademisk præstation hos unge, lavere søvnkvalitet, begrænsning af daglige aktiviteter, og humørsvingninger⁵.

Mange kvinder, der oplever svær dysmenorré udvej til over-the-counter medicin til at lindre deres smerte. Sådanne over-the-counter medicin indeholder cyclooxygenase (COX) hæmmere, som forhindrer dannelsen af prostaglandiner⁶. Men, COX-hæmmere er forbundet med negative kardiovaskulære hændelser, og omkring 18% af kvinder med dysmenorré reagerer ikke på disse hæmmere⁷. Derfor er der behov for nye medikamenter til at reducere menstruations kramper. Da over kontraktilitet af livmoderen bidrager til patogenesen af dysmenorré, en mulig strategi kan være brugen af uterin relaxants.

Det er fordelagtigt at kvantificere virkningerne af potentielle afslappende stoffer i en model af naturligt forekommende spontane myometriale bølge-lignende sammentrækninger. Men hidtil, ingen effektiv ex vivo metode til testning af muskel-afslappende lægemidler i intakt uterus er blevet beskrevet. I øjeblikket, isometrisk spænding målinger anvendes til at evaluere afslappende narkotika effekter. Under sådanne målinger, en uterin muskel strimmel opretholdes på en konstant længde under preload i et vævs bad, mens kraften af uterin muskelsammentrækninger registreres før og efter oxytocin stimulation i nærværelse af eller fravær af en afslappende stof. Selv om denne fremgangsmåde er meget nyttig, det kræver dyrt udstyr. Endvidere ligner isometriske sammentrækninger ikke de spontane myometriale bølgelignende sammentrækninger, der naturligt forekommer i den intakte uterus. Entydigt kan uterin myometriale bølger i gnavere visualiseres som uterin horn motilitet, når hele reproduktions kanalen (æggestokke, ovikanaler, uterus, og vagina) opretholdes i en bufferopløsning. Her præsenterer vi en ex vivo-metode til overvågning af den spontane motilitet af den intakte muse livmoder placeret i en Petri skål indeholdende oxygeneret Krebs buffer. Vi beskriver også en algoritme til kvantificering af motilitet ved hjælp af MATLAB motion tracker. Denne nye tilgang giver et nemt og billigere alternativ til at teste det afslappende potentiale af naturligt forekommende retsmidler og syntetiske forbindelser.

Protocol

Alle procedurer med dyr er blevet godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg på Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 måned-gamle F2-129S-C57BL/6 seksuelt-modne hunmus blev brugt i studiet. Forsigtig: Sørg for sikkerhed ved at bære en laboratorie frakke, maske og handsker, når du arbejder med dyr og biologisk farlige materialer. 1. klargøring af opløsningen Forbered Krebs buffer, som indeholder:…

Representative Results

Figur 1 viser repræsentative billeder, der er taget under hele isolations proceduren for reproduktions kanalen, som er beskrevet i denne protokol. For at undgå at forurenes bufferen med pels, hvilket ville formindske videokvaliteten, fugtet vi muse legemet med 70% ethanol. Den vigtigste benchmark for dissektion afsnit af protokollen er at finde urinblæren. Livmoderen og vagina vil blive placeret ringere end urinblæren. For at teste den protokol, vi behandlede …

Discussion

Her beskrev vi en metode til vurdering af spontan kontraktilitet af hele gnaver reproduktions kanalen, som omfatter æggestokkene, ovikanalerne, livmoder horn og vagina. Vi brugte en lignende metode til at demonstrere den afslappende effekt af phenylephrin på spontan uterin motilitet¹³, men i fortiden var vi ude af stand til at levere kvantitative analyse af dataene. I dette arbejde, vi udviklet en algoritme til kvantitativ motilitet dataanalyse ved hjælp af MATLAB motion tracking modul. Dette e…

Materials

Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2– 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later