O objetivo deste método é gerar um modelo in vivo de angiogênese tumoral por xenoenxertos de células tumorais de mamíferos em um embrião de zebrafish que tem vasos sanguíneos com rótulo fluorescentamente. Por imagem do Xenoenxerto e vasos associados, uma medida quantitativa da resposta angiogênica pode ser obtida.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
A angiogênese tumoral é um alvo-chave da terapia anticancerígena e este método foi desenvolvido para fornecer um novo modelo para estudar este processo in vivo. Um Xenoenxerto de zebrafish é criado através da implantação de células tumorais de mamíferos no espaço perivitelínico de dois dias-embriões de zebrafish pós-fertilização, seguidos pela mensuração da extensão da resposta angiogênica observada em um desfecho experimental até dois dias pós-implante. A vantagem chave a este método é a habilidade de quantificar exatamente a resposta angiogênica do anfitrião do zebrafish ao enxerto. Isto permite a examinação detalhada dos mecanismos moleculars assim como o anfitrião contra a contribuição do tumor à resposta angiogênica. Os embriões xenografados podem ser submetidos a uma variedade de tratamentos, como a incubação com potenciais fármacos antiangiogénese, a fim de investigar estratégias para inibir a angiogênese tumoral. A resposta angiogênica também pode ser imaged ao vivo, a fim de examinar processos celulares mais dinâmicos. A técnica experimental relativamente pouco exigente, custos de manutenção baratos de zebrafish e curto cronograma experimental tornam este modelo especialmente útil para o desenvolvimento de estratégias para manipular a angiogênese tumoral.
Introdução
A angiogênese é uma das características clássicas do câncer e representa um alvo de terapia anticancerígena1,2. Para estudar esse processo, foram criados modelos de câncer de Xenoenxerto, implantando células tumorais de mamíferos em animais como camundongos3. Um modelo do xenograft do zebrafish foi desenvolvido igualmente, que envolva a implantação de pilhas do tumor em 2 dias do borne da fertilização (DPI) zebrafish que conduz ao crescimento rápido de vasos sanguíneos do zebrafish no xenograft4.
Este protocolo descreve um modelo in vi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. preparação de agulhas de microinjecção
- Gire sobre um extrator da micropipeta e ajuste os seguintes parâmetros (calibrados para o modelo do extrator da micropipeta alistado na tabela dos materiais): calor, 680; Puxe, 75; Velocidade, 40; Tempo, 55; Pressão: 530.
- Fixe um capilar de vidro de borosilicato no extrator de micropipeta e puxe o capilar para fazer duas agulhas. Repita o número de agulhas que desejar.
2. cultura celular para implantação
Nota: Ao usar este protocolo, qualquer linha celular de câncer de mamíferos pode ser usada para a implantação em....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Por meio da imagem de um Xenoenxerto individual em 6, 24 e 48 HPI, a resposta angiogênica em diferentes temporais pode ser calculada como mostrado na Figura 1a-C. A maior resposta angiogênica é observada entre 24-48 h pós-implante, com os níveis máximos de vascularização do enxerto observados em torno de 2 DPI (Figura 1a-C). Um filme de lapso de tempo de uma resposta angiogênica típica a um xenog.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O primeiro passo crítico no protocolo é a implantação de células tumorais. É essencial que as células são injetadas em um local que permitirá que o xenograft implante com sucesso no embrião sem fazer o embrião edematoso. Uma injeção que é muito anterior pode permitir que as células se movam em direção ao coração, bloqueando a corrente sanguínea e levando ao edema, enquanto uma injeção que é muito posterior resultará em um Xenoenxerto mal implantado. Uma injeção anterior é melhor evitada introduzindo a agulha através do s.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Sr. Alhad Mahagaonkar pela gestão da instalação de zebrafish da Universidade de Auckland e pela unidade de pesquisa de imagens biomédicas, escola de ciências médicas da Universidade de Auckland, para assistência na microscopia confocal de lapso de tempo. Este trabalho foi apoiado por um Conselho de pesquisa em saúde da Nova Zelândia projeto Grant (14/105), uma sociedade real de Nova Zelândia Marsden Fund Project Grant (UOA1602) e um Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) concedido a J.W.A.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cilindro de ar | BOC | 011G | Xenotransplante |
| B16-F1 células | ATCC | Cultura de células | |
| BD Matrigel LDEV-free (mistura de matriz extracelular) | Corning | 356235 | Xenotransplante |
| Capilares de vidro borosillicado | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Comprimento = 10 cm Célula de injeção celular |
| Placa de cultura 35 mm de diâmetro | Thermofisher NZ | NUN153066 | Piscicultura |
| Placa de cultura de células 100 mm de diâmetro | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Piscicultura |
| Frasco de cultura de células 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cultura de células |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Marcação celular, concentração de estoque (10 mM em DMSO), concentração de trabalho (0,2 μ M em meio sem soro) |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D8418 | Tratamento medicamentoso, Marcação celular |
| E3 Meio (60x em 2 L de água) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2· 2H2O 9,78 g MgCl2· 6H2O ajusta para pH 7.2 com NaOH | Internamente [1] | Piscicultura | |
| Etil-3-aminobenzoato metanossulfonato (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplante, Ponta de filtro de imagem |
| 1.000 μ L | VWR | 732-1491 | Usado durante várias etapas |
| Ponta do filtro 200 μ L | VWR | 732-1489 | Usado durante várias etapas |
| Ponta do filtro 10 μ L | VWR | 732-1487 | Usado durante várias etapas |
| Microscópio de fluorescência | Leica | MZ16FA | Preparação de embriões |
| FBS (origem neozelandesa) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Luvas de cultura celular |
| Qualquer marca | Usado durante várias etapas | ||
| Câmara de contagem de células do hemocitômetro Neubauer | HawksleyVet | aprimoradoAC1000 | Xenotransplante |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cultura celular, Rotulagem celular |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Marcação celular, Concentração de estoque (1 mg/ml em DMSO), concentração de trabalho (6 μ g/ml em meio sem soro) |
| Baixo ponto de fusão, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplante |
| Azul de metileno | sigma-Aldrich | M9140 | Microloader de piscicultura |
| 0.5-20 μ Ponta de pipeta L para carregar microcapilares | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplante |
| Micropipetas | Qualquer marca | Usado durante várias etapas | |
| Extrator de micropipetas P 87 | Instrumentos | Xenotransplante | |
| Incubadora de gaiola de microscópio | Okolab | Imagem de lapso de tempo | |
| Microondas | Qualquer marca comercial | Óleo mineral de imagem | |
| Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplante | |
| Meios essenciais mínimos (MEM) - alfa | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cultura de Células |
| MPPI-2 Injetor de Pressão Instrumentação | Xenotransplante | ||
| Narishige micromanipulador Narishige | Grupo | NarishigeXenotransplante | |
| Nikon D Eclipse C1 Microscópio Confocal | Nikon | Imaging | |
| N-Feniltioureia (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Piscicultura |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cultura celular |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | 15140122 | Cultura celular |
| S1 pipeta filler | Thermoscientific | 9501 | Cultura de células |
| Stripette sorológica 10 mL | Corning | 4488 | Cultura de células |
| Stripette sorológica 25 mL | Corning | 4489 | Cultura de células |
| Stripette sorológica 5 mL | Corning | 4485 | Cultura de células |
| Stripette sorológica 2 mL | Corning | 4486 | Cultura de células |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Piscicultura |
| Incubadora de cultura de tecidos | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cultura de células |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Tratamento medicamentoso | |
| Pipeta de transferência 3 mL | Mediray | RL200C | Piscicultura |
| Tripsina/EDTA (0,25%) | Life Technologies | T4049 | Pinças de cultura de células |
| Ferramentas de Fine Science | 11295-10 | Software | |
| Volocity para piscicultura (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Análise de imagem |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
