CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out
Summary
Burada sunulan, CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, akolotl spinal tellerinde zaman ve uzaya kısıtlı gen vuruş yapmak için bir protokoldür ve ardından Electroporation.
Abstract
Axolotl, omuriliği tamamen yeniden üretebilmek için eşsiz bir yetenektir. Bu büyük ölçüde, ependim tüp reform ve spinal kord yaralanmasından sonra kayıp nöronlar ayırt çoğalırlar yaşam boyunca nöral kök hücreleri (nscs) olarak kalan ependim hücreler kaynaklanmaktadır. Bu nscs ‘nin pluripotkans sonrası gelişimini nasıl koruyacağı ve spinal kord yaralanması üzerine çoğalırlar tam ön yaralanma yapısının yeniden çözülmesi, memelinin spinal tellerinin nasıl rejenere olduğu ve potansiyel tedavi seçeneklerinin nasıl ortaya çıktığı konusunda değerli bilgiler sunabilir. Kısıtlı bir süre içinde nscs ‘nin belirli alt kümelerinde gen çarpması gerçekleştirme, kalkınma müdahaleci etkileri ile şaşırtmadan bu rejeneratif süreçlerin arkasındaki moleküler mekanizmaların incelenmesi sağlayacaktır. Burada açıklanan, CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak Axolotl omurilik NSCs içinde gen knock-out gerçekleştirmek için bir yöntemdir. CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, Elektroporasyon sonrasında, hedef genler, NSCs ‘de omuriliğin belirli bölgelerinde istenen bir zaman noktasında yıkıldı, spinal kord NSCs ‘de Moleküler çalışmalar için izin Rejenerasyon.
Introduction
Çoğu omurgasının omuriliği, kalıcı sakatlığa yol açan yaralanma sonrasında yeniden üretilemiyor. Axolotl gibi birçok Salamanders önemli istisnalar içindedir. Axolotl tamamen yapısal olarak özdeş bir omurilik yeniden üretebilir ve tamamen omurilik fonksiyonunu geri. Axolotl omurilik rejeneratif kapasitinin çoğunu ependim hücrelerden kaynaklanmaktadır. Bu hücreler merkezi kanalı hizalar ve memelilerin aksine, Axolotl ependim hücreler nöral kök hücreler (nscs) sonrası embriyonik gelişim olarak kalır. Omurilik yaralanması (örneğin, bir kuyruk amputasyonu) sonra, bu nscs ependim tüp regrow çoğalırlar ve kayıp nöronların yerine ayırt1,2,3. Axolotl omurilik NSCs ‘lerin pluripotent olarak kaldığı ve yaralanma sonrasında aktif hale getirilmesinde, insan hastaları için yeni terapötik stratejiler geliştirme konusunda değerli bilgiler temin edilebilir.
Crispr-Cas9 gen knock-out tekniğinde yapılan ilerlemeler nedeniyle, deşifre gen fonksiyonunun çökmesini gerçekleştirmek daha kolay hale gelmiştir ve semenderlerin4,5 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin geniş uygulanabilirliğini göstermiştir. 6 , 7 , 8. tam Axolotl genom ve transkriptom son sürümü şimdi herhangi bir genomik Locus hedeflenmesini sağlar ve off-hedef etkileri için daha iyi değerlendirmek için9,10,11,12 , 13 ‘ ü , 14. Crispr-Cas9 sistemi15kullanarak aksiyolotlar içinde knock-out ve knock-in için iyileştirilmiş protokoller geliştirilmiştir. Cas9 protein-Grna ribonukleoprotein (RNP) şeklinde Crispr-Cas9 makinenin teslimi, Cas9 ve Grna-kodlama plazmids4kullanarak daha verimli olduğu gösterilmiştir. Bu büyük olasılıkla RNP Plasmid vektörler daha küçük olması nedeniyle, onun yeteneği hemen DNA tatili oluşturmak ve RNA bozulması gRNA koruma. Buna ek olarak, RNPs kullanarak transkripsiyon ve çeviri atlar; Böylece, Plasmid elemanları farklı bir türden türetildiği zaman Organizatör gücü ve optimum kodon kullanımı gibi sorunları önler.
Fonksiyon kaybı çalışmaları, ilgi genlerinin potansiyel işlevlerini araştırmak için genel yaklaşımlardan biridir. Rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu incelemek için, bir vuruş ideal gelişim üzerindeki etkileri önlemek için bir yaralanma hemen önce yapılmalıdır. Ayrıca, knock-out hem NSCs hem de rejenerasyon bölgesi ile sınırlandırılmalıdır. Tüm NSCs ‘deki hedef geni (CRE-LoxP sistemlerinde bulunan beyinde de dahil olmak üzere) bir vuruş, sonuçların yorumlanmasında bulunabilen rejenerasyona bağlı olmayan efektler üretebilir. Neyse ki, Axolotl omuriliğin yapısı NSCs ‘de zaman ve boşluk kısıtlanması için benzersiz bir fırsat sağlar. Omurilik nscs çoğu merkezi kanal ile temas halinde ve merkezi kanal ile temas hücrelerin büyük çoğunluğu teşkil16,17. Bu nedenle, CAS9-Grna kompleksinin merkezi kanala enjekte edilmesi, ardından Elektroporasyon, belirli bir zamanda istenilen bölgede omurilik nscs ‘ye teslim edilmesini sağlar4,18,19. Bu protokol, bunun nasıl gerçekleştirileceğini, hedeflenen omurilik NSCs ‘de son derece penetran bir vuruş yapmaya neden olduğunu gösterir. daha sonra rejenerasyon ve NSC davranışı üzerindeki etkileri incelemek için sonraki analiz gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokol, Axolotl omuriliğinde NSCs ‘de zaman ve uzaya kısıtlı gen çarpmasına olanak sağlar. Geçerli protokol, NSCs ‘nin belirli bir zaman ve konumda yüksek penetrance ile belirli hedeflemesini sağlar. CRE-LoxP sistemini kullanırken ortaya çıkan beyin gibi diğer bölgelerde NSCs ‘deki gen knock-out ‘ d a n kaynaklanan potansiyel istenmeyen efektleri önler. Aynı zamanda kalıcı bir knock-out kaynaklanan gelişimsel etkileri önler, gen fonksiyonu rejenerasyon odaklı çalışma izin. Buna ek o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prof. Elly M. Tanaka ‘ya sürekli ve uzun vadeli destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Çin ‘in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC) Grant (317716), Güney Çin normal Üniversitesi (S82111 ve 8S0109) ve bir Çin doktora sonrası Bilim Vakfı Grant (2018M633067) itibaren araştırma başlangıç hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
