Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Samenvatting

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Samenvatting

Epitheliale lymfocyten uiten γδ T Cell receptor (γδ IEL) spelen een belangrijke rol in het immuunsysteem surveillance van het intestinale epitheel. Deels door het ontbreken van een definitief ligand voor de γδ T-cel receptor, blijft ons begrip van de regulatie van γδ IEL activering en hun functie in vivo beperkt. Dit vereist de ontwikkeling van alternatieve strategieën te ondervragen signalering trajecten die betrokken zijn bij de regulering van γδ IEL functie en de responsiviteit van deze cellen aan de lokale microenvironment. Hoewel γδ IELs op grote schaal worden begrepen om pathogeen translocatie te beperken, het gebruik van intravital Imaging is van cruciaal belang voor het begrijpen van de spatiotemporal dynamiek van IEL/epitheel interacties op Steady-State en in reactie op invasieve pathogenen. Hierin presenteren we een protocol voor het visualiseren van IEL trekgedrag in de kleine intestinale mucosa van een GFP γδ T Cell reporter muis met omgekeerde spinnen schijf confocale laser microscopie. Hoewel de maximale Imaging diepte van deze aanpak is beperkt ten opzichte van het gebruik van twee-foton laser-scanning microscopie, spinnen schijf confocale laser microscopie biedt het voordeel van hoge snelheid Beeldacquisitie met verminderde foto bleken en photodamage. Met behulp van 4D beeldanalyse software, T Cell surveillance gedrag en hun interacties met naburige cellen kunnen worden geanalyseerd na experimentele manipulatie om extra inzicht te geven in IEL activering en functie binnen de intestinale mucosa.

Inleiding

Epitheliale lymfocyten (IEL) bevinden zich binnen het intestinale epitheel, en worden gevonden zowel langs de kelder membraan en tussen aangrenzende epitheelcellen in de laterale intercellulaire ruimte¹. Er is ongeveer één IEL voor elke 5-10 epitheelcellen; Deze IELs dienen als Sentinels om immuun toezicht van de grote uitgestrektheid van de intestinale epitheel barrière²te bieden. IELs het uitdrukken van de γδ T Cell receptor (TCR) bestaat uit tot 60% van de totale IEL populatie in de muizen dunne darm. Studies in γδ T-cel-gebrekkige muizen tonen een grotendeels beschermende rol van deze cellen in reactie op intestinale....

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd in een vereniging van de beoordeling en accreditatie van laboratorium Animal Care (AALAC)-geaccrediteerd faciliteit volgens protocollen goedgekeurd door de Rutgers New Jersey Medical School vergelijkende geneeskunde middelen.

1. muis voorbereiding

Opmerking: De volgende procedure, met inbegrip van dierlijke voorbereiding en chirurgie, duurt 30 tot 40 min. voorafgaand aan de operatie, zet de Microscoop en warming-up van de bijgevoegde incubator op de Microscoop tot 37 ° c.

1. Voer experimenten uit op 8 – 10 weken oud TcrdEGFP muizen op een C57BL/6 achtergrond,....

Resultaten

Met behulp van intravital Imaging van TcrdEGFP reporter muizen, hebben we eerder aangetoond dat γδ IELs vertonen een dynamisch surveillance gedrag, waarin zij patrouilleren het epitheel door te migreren langs de kelder membraan en in de laterale intercellulaire ruimte (LIS) op steady staat (Figuur 2, film 1).

Deze benadering kan ook worden gebruikt om te evalueren hoe de remming van specifieke cel signalering paden en/of receptoren invloeden γδ IE.......

Discussie

De ontwikkeling van intravital microscopie technieken heeft een ongekende kans om de reorganisatie van subcellulaire structurenacht^,9,22, cel-cel interacties^{12, 25} en het migrerende gedrag van de cel¹³,^{14,15,16,26<.......}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35 mm schotel, No. 1.5 Dekglasje	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Hypodermische naalden - 27 G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Tuberculine-sering	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Dissectiescharen	Thermo Fisher Scientific	08-940
Elektrocauter	Thermo Fisher Scientific	50822501
Gesloten incubatiekamer	OKOLAB		Microscoop
Oognaalden, Grootte #3; 1/2 Cirkel, Taper Point, 12 mm koordlengte	Roboz	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) met Start, Track, XT modules	Bitplane		Software
Omgekeerde DMi8	Leica		Microscoop
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesie
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas schaar 3"” (7,5 cm) Lang 5 x 0,15 mm Rechte Scherpe	Roboz	RS-5600
Niet-absorbeerbare chirurgische hechtdraad, Zijde Spool, Zwart Gevlochten	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25"” (11 cm) Lange Hoekige Gladde 1,2 mm Tip	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointment	Dechra		Smerende Oogzalf
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 met een 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersie objectief, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diodelaser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diodelaser	Andor		Confocal systeem
Xylazin	Akorn		Anesthesie