تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية
Summary
هنا، نقدم بروتوكولًا لتوليد بيانات نسخ عالية الجودة وواسعة النطاق لخلايا واحدة من جزر البنكرياس البشرية المعزولة باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المستندة إلى قطرات.
Abstract
تتكون جزر البنكرياس من خلايا الغدد الصماء ذات أنماط التعبير الهرموني المميزة. تظهر خلايا الغدد الصماء اختلافات وظيفية استجابة للظروف الطبيعية والمرضية. والهدف من هذا البروتوكول هو توليد بيانات عالية الجودة وواسعة النطاق لنسخ كل نوع من خلايا الغدد الصماء باستخدام تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية القائمة على قطرات. ويمكن استخدام هذه البيانات لبناء ملف تعريف التعبير الجيني لكل نوع من خلايا الغدد الصماء في الظروف العادية أو المحددة. تتطلب العملية معالجة دقيقة، وقياس دقيق، ومراقبة صارمة للجودة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف الخطوات التفصيلية لانفصال جزر البنكرياس البشرية، والتسلسل، وتحليل البيانات. وتبين النتائج التمثيلية لنحو 000 20 خلية من خلايا الISlet البشرية المفردة التطبيق الناجح للبروتوكول.
Introduction
جزر البنكرياس الإفراج عن هرمونات الغدد الصماء لتنظيم مستويات الجلوكوز في الدم. وتشارك خمسة أنواع خلايا الغدد الصماء، والتي تختلف وظيفيا ومورفولوجية، في هذا الدور الأساسي: α-الخلايا تنتج الجلوكاجون، بيتا خلايا الأنسولين، δ-الخلايا somatostatin، PP خلايا البنكرياس الببتيد، والخلايا الغريلين1. تحديد سمات التعبير الجيني هو نهج مفيد لتوصيف خلايا الغدد الصماء في الظروف العادية أو المحددة. تاريخيا، تم إنشاء التنميط التعبير الجيني للعد كله باستخدام microarrayوالجيل التالي RNA تسلسل 2،3،4،5،6،7 , 8.على الرغم من أن النسخ الجزيرة كلها غنية بالمعلومات لتحديد النصوص الخاصة بالأعضاء والجينات مرشح المرض، فإنه يفشل في الكشف عن عدم التجانس الجزيئي لكل نوع من خلايا الجزيرة. تم تطبيق تقنية الالتقاط بالليزر microdissection (LCM) للحصول مباشرة على أنواع محددة من الخلايا منالجزر9و10و11و12 ولكنها لا ترقى إلى نقاء الخلية المستهدفة السكان. للتغلب على هذه القيود، تم استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) لتحديد مجموعات خلايا الغدد الصماء المحددة، مثل خلايا αوβ13و14و15و16 , 17 سنة , 18-وعلاوة على ذلك، استخدم دوريل وآخرون نهجاً لفرز القوات المسلحة الكونغولية القائم على الأجسام المضادة لتصنيف خلايا بيتا إلى أربع مجموعات فرعية19. يمكن أيضا ً أن تكون خلايا جزيرة FACS التي تم فرزها مطلية بتسلسل الحمض النووي الريبي للخلايا المفردة. ومع ذلك، فإن الأساليب المستندة إلى لوحة تواجه تحديات في قابلية التوسع20،21،22.
لتوليد بيانات عالية الجودة وواسعة النطاق النسخ من كل نوع خلية الغدد الصماء، قمنا بتطبيق تكنولوجيا microfluidic على خلايا الإسداء البشري. منصة microfluidic يولد بيانات النسخ من عدد كبير من الخلايا المفردة في عالية الإنتاجية، عالية الجودة، وطريقة قابلة للتحجيم23،24،25،26،27. بالإضافة إلى الكشف عن الخصائص الجزيئية لنوع الخلية التي تم التقاطها في كمية كبيرة، تمكن منصة microfluidic عالية التحجيم تحديد أنواع الخلايا النادرة عند توفير خلايا كافية. وبالتالي، فإن تطبيق المنصة على جزر البنكرياس البشرية يسمح التنميط من الغريلين إفراز الخلايا، وهو نوع نادر من خلايا الغدد الصماء مع وظيفة معروفة قليلا بسبب ندرة28. في السنوات الأخيرة، تم نشر العديد من الدراسات من قبلنا وغيرها من الإبلاغ عن بيانات النسخ على نطاق واسع من الجزر البشرية باستخدام التكنولوجيا29،30،31،32، 33. وهذه البيانات متاحة للجمهور وموارد مفيدة لمجتمع الislet لدراسة عدم تجانس خلايا الغدد الصماء وآثارها في الأمراض.
هنا، نقوم بوصف بروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية القائم على قطرات، والذي تم استخدامه لإنتاج بيانات النسخ من حوالي 20,000 خلية من خلايا الجزر البشرية بما في ذلك α-, β-δ-, PP, الخلايا, ونسبة أصغر من الخلايا غير الغدد الصماء 32-يبدأ سير العمل بالجزر البشرية المعزولة ويصور خطوات انفصال خلايا جزيرة جزيرة، والتقاط خلية واحدة، وتحليل البيانات. ويتطلب البروتوكول استخدام الجزر الصغيرة المعزولة حديثا، ويمكن تطبيقه على الجزر الصغيرة من البشر والأنواع الأخرى، مثل القوارض. باستخدام سير العمل هذا، يمكن بناء أطلس خلية ليستيب غير متحيز وشامل في ظل خطوط الأساس وغيرها من الظروف.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر تقنيات الخلايا الواحدة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة منصة جديدة لتوصيف أنواع الخلايا ودراسة التغاير الجزيئي في جزر البنكرياس البشرية. اعتمدنا بروتوكول عزل الخلايا الواحدة الدقيقة المستندة إلى قطرات صغيرة وتحليل البيانات لدراسة الجزر البشرية. بروتوكولنا أنتج بنجاح الحمض النو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
- Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
- Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
- Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
- Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
