Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.
Abstract
Los islotes pancreáticos comprenden células endocrinas con patrones distintivos de expresión hormonal. Las células endocrinas muestran diferencias funcionales en respuesta a condiciones normales y patológicas. El objetivo de este protocolo es generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de cada tipo de célula endocrina con el uso de una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico basada en gotas. Estos datos se pueden utilizar para construir el perfil de expresión génica de cada tipo de célula endocrina en condiciones normales o específicas. El proceso requiere un manejo cuidadoso, una medición precisa y un riguroso control de calidad. En este protocolo, describimos pasos detallados para la disociación, secuenciación y análisis de datos de islotes pancreáticos humanos. Los resultados representativos de unas 20.000 células de islet único humano demuestran la aplicación exitosa del protocolo.
Introduction
Los islotes pancreáticos liberan hormonas endocrinas para regular los niveles de glucosa en sangre. Cinco tipos de células endocrinas, que difieren funcional y morfológicamente, están implicados en este papel esencial: las células producen glucagón, insulina de células, somatostatina de células de células PP, polipéptido pancreático de células PP y células de la ghrelina1. La generación de perfiles de expresión génica es un enfoque útil para caracterizar las células endocrinas en condiciones normales o específicas. Históricamente, todo el perfil de expresión génica del islet se generó utilizando microarray y secuenciación de ARN de próxima generación2,3,4,5, 7 , 8. Aunque todo el transcriptoma de islet es informativo para identificar las transcripciones específicas de órganos y los genes candidatos a la enfermedad, no logra descubrir la heterogeneidad molecular de cada tipo de célula de isla. La técnica de microdisección de captura láser (LCM) se haaplicado para obtener directamente tipos de células específicas de los islotes 9,10,11,12, pero se queda corto de pureza de la célula objetivo Población. Para superar estas limitaciones, se ha utilizado la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para seleccionar poblaciones específicas de células endocrinas, como las células13,14,15,16 , 17 , 18. Por otra parte, Dorrell y otros utilizaron un enfoque de clasificación facS basado en anticuerpos para clasificar las células en cuatro subpoblaciones19. Las células de los isletes ordenadas por FACS también se pueden chapar para la secuenciación de ARN de células individuales; sin embargo, los métodos basados en placas se enfrentan a desafíos en escalabilidad20,21,22.
Para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de cada tipo de célula endocrina, aplicamos tecnología microfluídica a las células de los isletes humanos. La plataforma microfluídica genera datos de transcriptoma a partir de un gran número de células individuales de una manera escalable, de alto rendimiento, alta calidad y escalable23,24,25,26,27. Además de revelar las características moleculares de un tipo de célula capturada en una gran cantidad, la plataforma microfluídica altamente escalable permite la identificación de tipos de células raras cuando se proporcionan suficientes células. Por lo tanto, la aplicación de la plataforma a los islotes pancreáticos humanos permitió perfilar células de ghrelina-secreting, un tipo de célula endocrina rara con función poco conocida debido a su escasez28. En los últimos años, varios estudios han sido publicados por nosotros y otros informando datos de transcriptoma a gran escala de islotes humanos utilizando la tecnología29,30,31,32, 33. Los datos están a disposición del público y recursos útiles para que la comunidad de islote estudie la heterogeneidad de células endocrinas y su implicación en las enfermedades.
Aquí, describimos un protocolo de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basado en gotas, que se ha utilizado para producir datos de transcriptoma de aproximadamente 20.000 células de islos humanos, incluyendo las células de “, “, “, “, “, “, “, “y” y una proporción más pequeña de células no endocrinas 32. El flujo de trabajo comienza con islotes humanos aislados y representa los pasos de disociación de células de islotes, captura de una sola célula y análisis de datos. El protocolo requiere el uso de islotes recién aislados y se puede aplicar a los islotes de los seres humanos y otras especies, como los roedores. Con este flujo de trabajo, se pueden crear atlas de celda de islet imparciales y completos bajo línea base y otras condiciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las tecnologías de una sola célula desarrolladas en los últimos años proporcionan una nueva plataforma para caracterizar los tipos celulares y estudiar la heterogeneidad molecular en islotes pancreáticos humanos. Adoptamos un protocolo de aislamiento microfluídico de una sola célula basado en gotas y análisis de datos para estudiar islotes humanos. Nuestro protocolo produjo con éxito datos de secuenciación de ARN de más de 20.000 células de islotes humanos individuales con variaciones relativamente pequeñas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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