عزل الخلايا الظهارية اللعابية من الغدد اللعابية البشرية للنمو في المختبر كما ساليسفيرس أو الطبقات الأحادية
Summary
نقدم طريقة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية المشتقة من الغدة اللعابية البشرية الأولية. هذه الخلايا تظهر أنماط التعبير الجيني متسقة مع كونها من أصل ظهاري اللعابي ويمكن زراعتها كما ساليسفيرس على مصفوفات غشاء الطابق السفلي المستمدة من الخلايا السرطانية Engelbreth-Holm-Swarm أو كطبقات أحادية على أطباق الثقافة المعالجة.
Abstract
الغدد اللعابية هي موقع مهم كبير للباحثين المهتمين في جوانب متعددة من الأمراض البشرية. هدف واحد من الباحثين هو استعادة وظيفة الغدد التالفة من العلاجات الإشعاعية أو بسبب الأمراض المرتبطة بمتلازمة Sjögren. والهدف الثاني للباحثين هو تحديد الآليات التي تتكرر بها الفيروسات داخل الأنسجة الغدية حيث يمكنها بعد ذلك الوصول إلى السوائل اللعابية الهامة للانتقال الأفقي. وتبرز هذه الأهداف الحاجة إلى نموذج قوي ويمكن الوصول إليه في المختبر للغدة اللعابية التي يمكن استخدامها من قبل الباحثين المهتمين في المجالات المذكورة أعلاه وكذلك مجالات البحوث ذات الصلة. هنا نناقش بروتوكول بسيط لعزل الخلايا الظهارية من الغدد اللعابية البشرية ونشرها في المختبر. ويمكن تحسين بروتوكولنا لتلبية احتياجات الدراسات الفردية. باختصار، يتم فصل الأنسجة اللعابية ميكانيكيًا وعنأنزيمي لعزل الخلايا المفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا. اختيار الخلايا الظهارية يحدث عن طريق الطلاء على مصفوفة غشاء الطابق السفلي في وجود وسائل الإعلام الأمثل لتعزيز نمو الخلايا الظهارية. ويمكن الحفاظ على هذه الثقافات الناتجة كمجموعات ثلاثية الأبعاد، تسمى “ساليسفيرز”، أو تزرع كطبقة أحادية على أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المعالجة. ينتج عن هذا البروتوكول نمو السكان غير المتجانسين من الخلايا الظهارية بشكل رئيسي التي يمكن نشرها لمدة 5-8 ممرات (15-20 تضاعف السكان) قبل أن تخضع للشيخوخة الخلوية.
Introduction
في الثدييات يتم تنظيم الغدد اللعابية في 3 أزواج من الغدد اللعابية الرئيسية: الغدد النكفية، تحت الفك السفلي، وتحت اللسان. هناك أيضا سلسلة من الغدد الثانوية الموجودة على اللسان ومتناثرة في جميع أنحاء تجويف الفم1. الغدد الرئيسية هي المسؤولة عنحجم الجزء الأكبر من اللعاب المنتجة 2. بالإضافة إلى توفير الحماية المضادة للميكروبات من خلال عوامل سرية ، فإن اللعاب مهم في عملية مضغ وتزييت الطعام أثناء مروره عبر المريء2. على هذا النحو ، يمثل خلل الغدة اللعابية مشكلة طبية حيث يكون المصابون غير القادرين على إنتاج ما يكفي من اللعاب أكثر عرضة لتطوير أمراض مثل تجاويف الأسنان أو داء المبيضات الفموي3. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي انخفاض اللعاب إلى صعوبة أكبر في تناول الطعام وهضمه مما يؤثر بشكل كبير على نوعية الحياة.
يوجد خلل في الغدة اللعابية في المقام الأول في المرضى الذين يعانون من متلازمة Sjögren، اضطراب المناعة الذاتية، أو في المرضى الذين يعانون من سرطان الرأس والرقبة الذين خضعوا للعلاج بالتشعيع3،4،5، 6. أسيني إفرازي تالف داخل الغدد نتيجة للمناعة الذاتية أو العلاج الإشعاعي لا تخضع للتجديد الذاتي، مما يؤدي إلى مريض يعيش مع ضرر لا رجعة فيه6. وقد جذبت دراسة الغدد اللعابية أيضا الاهتمام أو الباحثين المهتمين في آليات مسببات الأمراض الفيروسية. بعض مسببات الأمراض، مثل الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV)، تتكرر باستمرار داخل الغدد اللعابية، والذي يسمح بعد ذلك بانتقال الفيروس الوليد إلى مضيف جديد عن طريق اللعاب7،8. وهكذا، هناك حاجة غير ملباة لتطوير نماذج قوية واستنساخفي المختبر من أنسجة الغدة اللعابية لمعالجة وفهم مجموعة متنوعة من المشاكل الطبية.
وقد استخدمت عدة نماذج من نظام الغدة اللعابية المورين كنقطة انطلاق لفهم وتوصيف الخلايا الظهارية المختلفة التي تشكل الغدد اللعابية9،10. هناك اختلافات واضحة وكبيرة بين الغدد البشرية والغدد اللعابية المورين11. أبرزها الغدة النكفية البشرية أكبر بالنسبة للغدة تحت الفك السفلي في حين أن الماوس تحت الفك السفلي وparotid متشابهة إلى حد كبير في حجم1،2،11. في حين توجد خطوط الخلايا تحت الفك السفلي البشرية الخالدة، هناك مخاوف كبيرة من أن الخلايا الخالدة لا تحافظ بدقة على النمط الظاهري للأنسجة الأولية والمخاوف الثانوية التي لا تستمد الخلايا الخالدة في الواقع من ظهارة اللعاب ية نفسها12. لهذه الأسباب هناك اهتمام والحاجة إلى دراسة الأنسجة اللعابية الأولية من البشر.
هنا نقوم بوصف بروتوكول لعزل الخلايا الظهارية الأولية من الغدد اللعابية البشرية لثقافة الأنسجة. ويستند بروتوكولنا على أعمال Pringle وآخرون وتران وآخرون مع التعديلات التي أدخلت لتبسيط إجراءاتها عموما13،14. أولاً، في حين أن بروتوكول تران وآخرون يدعو إلى حضانة لمدة خمس ساعات طويلة لهضم الأنسجة اللعابية بشكل أنزيمي، فإن بروتوكولنا المعدل كان ناجحاً بأقل من ساعة واحدة من الحضانة، على غرار ما هو الحال في برينغل وآخرون. ثانيا، نحن نستخدم إنزيمات مختلفة لهضم الأنسجة، وأبرزها أننا لا نستخدم التربسين كما هو مستخدم في بروتوكول تران وآخرون الأصلي، ولكن بدلا من ذلك استخدام خليط من dispase والكولاجين. نحن نفضل تجنب التربسين في خطوات الهضم الأولية كما اقترحت دراسة حديثة أن الهضم الأولي للأنسجة اللعابية عن طريق التربسين يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا، وربما عن طريق فقدان مجموعة نادرة من الخلايا الجذعية15. وأخيرا، نحن ثقافة ساليسفيرس على سطح مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BMM) باستخدام وسائل الإعلام المتاحة تجاريا وضعت أصلا لنشر الخلايا الظهارية القصبية. يمكن استخدام بروتوكولنا لعزل الخلايا اللعابية من الغدد النكفية، تحت الفك السفلي، وتحت اللسان. هذه الخلايا تعبر عن الميليز اللعابي وغيرها من الجينات الخاصة اللعابية تشير إلى أنها تحافظ علىالنمط الظاهري مماثلة لتلك التي من الخلايا الظهارية acinar اللعاب7 . لقد نجحنا في توليد الثقافات اللعابية من > 50 عينة الأنسجة البشرية الأولية باستخدام هذه المنهجية. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة حفظ الخلايا اللعابية الأولية بالتبريد لاستخدامها في وقت لاحق.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمثل الخلل اللعابي مصدر قلق لنوعية الحياة لأولئك الذين يعانون من متلازمة Sjögren وكذلك أولئك الذين يخضعون للعلاج الإشعاعي للسرطانات المجاورة للغدد اللعابية3،4،5، 16. واحد العلاج المقترح لعلاج هؤلاء المرضى هو زراعة الخلاي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر جيمس ب. بريدجز على تقديم توجيهات هامة بشأن المنهجيات التي ينطوي عليها زراعة الخلايا الأولية. ماثيو ج. بيوكلير بدعم من المعاهد الوطنية للتدريب الصحي منحة T32-ES007250. كما تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح R01-AI121028 و R21-DE026267 الممنوحة لوليام ميلر.
Materials
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren’s syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
