En integrert celle manipulasjon plattform er utviklet for bruk i forbindelse med en enkelt-sonde masse massespektrometri oppsett for on-line analyse av individuelle suspensjon celler under ambient forhold.
Enkelt cellemasse massespektrometri (SCMS) muliggjør sensitiv deteksjon og nøyaktig analyse av bredt spekter av cellulære arter på den enkelte cellenivå. Den single-sonde, en Mikroskala prøvetaking og ionisering enhet, kan kombineres med en masse spektrometer for on-line, rask SCMS analyse av cellulære bestanddeler under omgivelsesforhold. Tidligere var den single-probe SCMS teknikken primært brukes til å måleceller immobilisert på et substrat, noe som begrenser hvilke typer celler for studier. I den nåværende studien, den single-sonde SCMS-teknologi har blitt integrert med en celle manipulasjon system, vanligvis brukes for in vitro befruktning. Denne integrerte celle manipulasjon og analyse plattformen bruker en celle-valg sonde å fange identifiserte individuelle flytende celler og overføre celler til Single-sonde spissen for Mikroskala lyse, etterfulgt av umiddelbar masse massespektrometri analyse. Denne fangst og overføre prosessen fjerner celler fra den omkringliggende løsning før analyse, minimere innføringen av matrise molekyler i massen massespektrometri analyse. Dette integrerte oppsettet er i stand til SCMS analyse av målrettede pasient-isolerte celler til stede i kroppsvæsker prøver (f. eks, urin, blod, spytt, etc.), noe som åpner for potensielle anvendelser av SCMS analyse til Human medisin og sykdoms biologi.
Human biologi, spesielt sykdoms biologi, er i økende grad forstått å være et resultat av aktiviteter på nivået av individuelle celler, men de tradisjonelle analytiske metoder, som for eksempel flytende kromatografi masse massespektrometri (LCMS), er vanligvis brukt til å analysere prøver fremstilt fra populasjoner av celler, mens ervervet molekylær informasjon ikke kan nøyaktig representere de kjemiske prosessene på det enkelte cellenivå. Disse standard, tradisjonelle metoder er ikke i stand til å skjelne effekten av cellulære heterogenitet på en analytisk måling, og prosessen med å ødelegge og blande cellene for å forberede lysat potensielt fører til endring eller tap av mobilnettet komponenter1,2. Disse begrensningene av tradisjonelle metoder er spesielt viktig i analysen av pasient celler, der de oppnådde prøvene kan inneholde en kompleks blanding av mange forskjellige celletyper. For å overkomme disse manglene, enkelt celle molekylær analysemetoder, inkludert single Cell Mass massespektrometri (SCMS) metoder, er i økende grad utvikles og brukes på bioanalysis, spesielt av cellulære metabolitter og lav molekylvekt biomolekyler3,4.
Den første SCMS teknikker utviklet brukt vakuum-baserte teknikker for å utføre analysene under ikke-ambient forhold2,5,6,7,8,9, 10,11. Ikke-ambient SCMS teknikker er i stand til å analysere cellulære lipider og metabolitter, men krever prøve forbehandling under kunstige forhold, og derfor er ikke egnet for sanntids analyse. Prøven forberedelse prosessen for ikke-ambient analyse omfatter tillegg av matrisen komponenter, og dette preparatet kan endre cellulære komponenter fra sitt naturlige miljø12. Derfor benyttes ambient Mass massespektrometri (MS) teknikker, som ikke krever et vakuum for prøvetaking miljøet, for å analysere celler i en nær-native miljø. Ikke å ha et vakuum miljø gir allsidighet i eksperimentell design; kameraer kan legges til å overvåke cellulære prosessen og mykere ionisering teknikker kan kombineres med separasjon teknikker for å få bedre informasjon fra hver enkelt-celle eksperiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37, 38, 39,40 ,41,42.
Single-probe SCMS metoden er en ambient teknikk som analyserer Live, pattedyr kreftcelle linjer i en nær-native Environment21,43,44,45,46. I tillegg har single-probe enheten blitt brukt til andre masse massespektrometri applikasjoner, inkludert analyse av ekstracellulære molekyler i flercellede spheroids og MS Imaging av vev47,48,49 ,50,51,52. Men siden celle immobilisering på underlag er nødvendig for denne metoden, kan suspensjon celler ikke analyseres direkte ved hjelp av denne teknikken3,53. Derfor kunne SCMS-systemet med én sonde ikke brukes direkte til å prøve ikke-tilhenger enkeltceller, for eksempel ikke-tilhenger cellelinjer eller opphengs celler isolert fra pasientens blod eller andre kroppsvæsker54. I dette arbeidet, en integrert celle manipulasjon plattform (ICMP) er kombinert med single-sonde SCMS teknikk for å analysere Live, suspensjon celler på linje med minimal prøveforberedelse (figur 1)46. ICMP består av en invertert mikroskop for å overvåke celleutvalg, en glasscelle-utvalg sonde, en microinjector å fange individuelle flytende celler, en oppvarmet plate for å opprettholde celle temperatur, to celle manipulasjon systemer for å kontrollere romlig bevegelser av både glasscelle-utvelgelses sonde og Single-sonde, og et digitalt mikroskop for å observere celle overføring fra celle-valg sonde spissen til Single-sonde spissen. Den fabrikasjon av single-sonde er beskrevet i tidligere publikasjoner og vil ikke bli behandlet her21,48. ICMP/single-probe systemet er koplet til en høy oppløsning masse spektrometer. Dette integrerte oppsettet gjør det mulig å prøve ut identifiserte enkeltceller fra komplekse biologiske prøver med minimale effekter fra matrise molekyler.
Den integrerte celle manipulasjon og analyseplattform er konstruert for å utvide allsidigheten til Single-sonde MS metoden, slik at for on-line, rask analyse av ikke-tilhenger celler i en nær-native miljø. En stor fordel med teknikken er at minimal prøve forberedelser er nødvendig, slik at cellene blir analysert i forhold som etterligner deres standard tilstand. Spesielt kan enkelte celler av interesse være visuelt identifisert og valgt, minimere påvirkning av matrise effekt på MS ionisering effektivitet og samtidig opprettholde celler i deres naturlige miljø, slik at resultatene er mer representative celler innfødte status (figur S3). Denne teknikken kan potensielt brukes til å studere pasient celler suspendert i biofluids i fremtidige studier. En annen fordel med denne teknikken er det fleksible utvalget av prøvetaking løsemiddel. Det er viktig å inkludere acetonitril som den viktigste prøvetaking løsemiddel slik at Mikroskala lyse kan forekomme raskt. Potensielt, interne standarder (f. eks, isotopically-merket legemiddel forbindelser) kan tilsettes i prøvetaking løsemiddel for kvantifisering av molekyler av interesse (f. eks, legemiddel molekyler) fra individuelle celler, inkludert de kan spille en nøkkelrolle i revolusjonerer tilpasse narkotika behandlinger i fremtiden54.
Selv om dette integrerte systemet kan enkelt brukes til å analysere brede celleområder, er en begrensning av metoden at verken enkelt sonde eller celle utvalgs sonde er kommersielt tilgjengelig; dikterer behovet for optimalisering av mange parametre (f. eks, strømningshastighet, spenning, lengde mellom nano-ESI emitter og Ion overføring rør, etc.) før hvert eksperiment. På grunn av smallness av enkelt sonde og celle utvalgs sonde, kan miljø forstyrrelsene (f.eks. luftstrøm) føre til vanskeligheter med å etablere et knutepunkt mellom de to sonder. En kortsiktig løsning er bøying av Cellevalg sonden nær slutten for å minimere lengden av en gang. Fremtidig arbeid omfatter utvikling av en bolig for å sette de kritiske delene av oppsettet for å minimere miljøeffekter. På grunn av den begrensede mengden av mobil innhold og kort oppkjøps tid (~ 2-3 s) fra en celle, MS/MS analyse kan bare gjennomføres for relativt rikelig arter. Andre faktorer som påvirker deteksjons følsomheten inkluderer undertrykt ionisering effektivitet på grunn av innføringen av matrisen sammen med cellen og potensielle ion tap gjennom den utvidede ion overførings slangen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Naga Rama Kothapalli for sitt arbeid i å utvikle prøve forberedelser for både suspensjon celler og celle lysat eksperimenter. I tillegg forfatterne takker NIH (R01GM116116 og R21CA204706) for finansiering.
Acetontrile | Millipore Co. | AX0145-1 | Sampling solvent |
CellTram Vario | Eppendorf | 6221 | ICMP |
Copper wire | stores.ebay.com/jewelerheaven | Dead soft, round, 20 guage, 25 ft | Conductive union setup |
Digital stereomicroscope | Shenzhen D&F Co. | Supereyes T004 | Analysis |
Disposable micropipette, 1-5 µL | Rochester Scientific | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" | Friedrich & Dimmock, Inc. | MBT-005-020-2Q | Single-probe fabrication |
Epoxy resin | Devcon | Part No. 20945 | Single-probe fabrication |
Eppendorf cell manipulation system | Eppendorf | Transferman NK517800397-U.R. | ICMP |
External nut | VALCO*CHEMINERT | EN1 | Ion transfer tube fabrication |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388-500ML | Sampling solvent |
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm | Polymicro Technologies | TSP040105 | Single-probe fabrication, conductive union setup |
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm | Polymicro Technologies | 1068150015 | Conductive union setup |
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) | Fischer Sci | SH3006603 | Cell culture |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC | M-520 | Conductive union setup |
Laser puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Single-probe fabrication |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment | LY-C240 | Single-probe fabrication |
LTQ Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ Orbitrap XL | Analysis |
Microforge | Narishige, Co. | MF-9 | Cell-selection probe fabrication |
Microunion | IDEX Health & Science LLC | M-539 | Conductive union |
PEEK tubing, 1/32×0.005x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1576 | Conductive union setup |
PEEK tubing, 1/32×0.007x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1577 | Conductive union setup |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies | 15140-122 | Cell culture |
Petri dish, 35×10 mm | VWR | 25382-334 | Sample preparation |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 0780-50L | Cell culture |
Platinum wire | Narishige, Co. | Model PT-A | Microforge |
Power supply | Nikon | PSM-2120 | ICMP |
RPMI, 1X with Corning glutagro | Corning | 10-104-CV | Cell culture |
Single-bore tubes | Boralex | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD | IDEX Health & Science LLC | VHP-200-01x | Ion transfer tube fabrication |
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm | IDEX Health & Science LLC | U-1128 | Ion transfer tube fabrication |
Syringe, 250 µL | Hamilton | 1725LTN250UL | Sampling syringe |
T25 flask | CellStar | 690160 | Cell culture |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective | PB5500 | Analysis |
ThermoPlate | TokaiHit | 55R30N | ICMP |
TrypLE Express | Gibco | 12605-010 | Cell culture |
Tube cutter, for 1/16" stainless steel | SUPELCO | 58692-U | Ion transfer tube fabrication |
USB digital photography microscope | dx.com | SO2 25~500X | Analysis |
UV curing resin | Prime Dental | Item No. 006.030 | Single-probe fabrication |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Cell-selection probe fabrication |
Voltage housing | PicoChip | PCH-A00120 | ICMP/MS interface |
Wire cutter | Craftsman | 4 1/2 in end nipper | Conductive union setup |