वायरस से दूर उच्च उपज extracellular Vesicle तैयारी की शुद्धि
Summary
इस प्रोटोकॉल ev वर्षा, घनत्व ढाल ultracentrifugation को शामिल करके उच्च दक्षता और उपज के साथ virions से दूर extracellular vesicles (EVs) अलग, और कण पर कब्जा एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह और शुरू करने की कमी के लिए अनुमति देने के लिए मात्रा आवश्यकताओं, सभी EV अनुसंधान में उपयोग के लिए reproduible तैयारी में जिसके परिणामस्वरूप.
Abstract
extracellular vesicle (EV) अनुसंधान के क्षेत्र में प्रमुख बाधाओं में से एक आज एक वायरल संक्रमण सेटिंग में शुद्ध EV तैयारी को प्राप्त करने की क्षमता है. प्रस्तुत विधि virions से दूर EVs को अलग करने के लिए होती है (यानी, एचआईवी-1), पारंपरिक ultracentrifugation तरीकों की तुलना में एक उच्च दक्षता और उपज के लिए अनुमति देता है. हमारे प्रोटोकॉल तीन कदम शामिल हैं: EV वर्षा, घनत्व ढाल जुदाई, और कण पर कब्जा. डाउनस्ट्रीम परख (यानी, पश्चिमी धब्बा, और पीसीआर) सीधे कण पर कब्जा निम्नलिखित चलाया जा सकता है। यह विधि अन्य अलगाव तरीकों पर फायदेमंद है (यानी, ultracentrifugation) के रूप में यह कम से कम शुरू संस्करणों के उपयोग के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, यह कई ultracentrifugation कदम की आवश्यकता होती है वैकल्पिक EV अलगाव तरीकों की तुलना में अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल है. हालांकि, प्रस्तुत विधि कार्यात्मक EV assays के अपने दायरे में सीमित है के रूप में यह हमारे कणों से बरकरार EVs elute करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, इस विधि एक कड़ाई से अनुसंधान आधारित सेटिंग की दिशा में सिलवाया है और व्यावसायिक रूप से व्यवहार्य नहीं होगा.
Introduction
अनुसंधान extracellular vesicles (EVs) के आसपास केंद्रित, विशेष रूप से exossomes, EV का एक प्रकार 30-120 एनएम लेकर और तीन tetraspanin मार्करों CD81, CD9, और CD63 की उपस्थिति की विशेषता, मोटे तौर पर अलग करने के लिए तरीकों के विकास के द्वारा आकार दिया गया है और ब्याज के vesicles को शुद्ध. बहुमुखी तंत्र विच्छेदन करने की क्षमता जटिल और समय लेने वाली तकनीक है जो सामग्री, आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ विभिन्न रास्ते के माध्यम से उत्पन्न vesicles की एक विषम आबादी से बना नमूने उत्पन्न करने के कारण बाधित किया गया है, और घनत्व. हालांकि यह लगभग सभी EV अनुसंधान के लिए एक मुद्दा है, यह विशेष महत्व का है जब वायरल संक्रमण के संदर्भ में EVs का अध्ययन, virions और वायरस की तरह कणों के रूप में (VLPs) ब्याज की vesicles के लिए व्यास में समान हो सकता है. उदाहरण के लिए, मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) लगभग 100 एनएम व्यास है, जो लगभग कई प्रकार के ईवीएस के रूप में एक ही आकार का है। इस कारण से, हमने इन समस्याओं को हल करने के लिए एक उपन्यास EV आइसोलेशन कार्यप्रवाह डिज़ाइन किया है.
EV अलगाव के वर्तमान सोने के मानक ultracentrifugation है. इस तकनीक में विभिन्न आशय घनत्व का उपयोग किया जाता है, जो vesicles को प्रत्येक चरण 1,2में उच्च घनत्व कणों के अंतर अवसादन के साथ अपकेंद्रण द्वारा अलग करने की अनुमति देता है। बरकरार कोशिकाओं को हटाने के लिए कई कम गति centrifugation कदम आवश्यक हैं (300-400 x ग्राम 10 मिनट के लिए), सेल मलबे ($2,000 x ग्राम के लिए 10 मिनट), और apoptotic निकायों / इन प्रारंभिक शुद्धि उच्च गति ultracentrifugation द्वारा पीछा कर रहे हैं (100,000-200,000 x g के लिए 1.5-2 ज) तलछट EVs के लिए. धो कदम आगे EV शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है, तथापि, यह अलग EVs की संख्या में कमी में परिणाम है, जिससे कुल उपज 3,4कम . इस विधि की उपयोगिता आगे कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता द्वारा सीमित है (लगभग 1 x 108) और एक बड़े नमूना मात्रा (gt; 100 एमएल) पर्याप्त परिणाम प्राप्त करने के लिए.
बढ़ती चिंताओं को दूर करने के लिए, हाइड्रोफिलिक पॉलिमर के साथ vesicles की वर्षा हाल के वर्षों में एक उपयोगी तकनीक बन गया है। पॉलीथीन ग्लाइकोल (PEG), या अन्य संबंधित वर्षा अभिकर्मकों, उपयोगकर्ता बस पसंद के अभिकर्मक के साथ नमूना incubating द्वारा एक नमूना के भीतर vesicles, वायरस, और प्रोटीन या प्रोटीन-RNA समुच्चय नीचे खींचने के लिए अनुमति देता है, एक भी कम गति के बाद अपकेंद्रण1,2,5. हमने पहले सूचित किया है कि पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन की तुलना में ईवीएस को वेग देने के लिए खूंटी या संबंधित विधियों का उपयोग काफी अधिकउपज6 में होता है . इस रणनीति तेज है, आसान है, अतिरिक्त महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, आसानी से स्केलेबल है, और EV संरचना को बरकरार रखता है. हालांकि, इस विधि की promiscuous प्रकृति के कारण, जिसके परिणामस्वरूप नमूने मुक्त प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, EVs की एक श्रृंखला, और virions इस प्रकार वांछित जनसंख्या प्राप्त करने के लिए आगे शुद्धि की आवश्यकता सहित उत्पादों की एक किस्म होतेहैं 1 ,2,7,8.
विभिन्न वर्षण विधियों से प्राप्त ईवीएस की विषमता को दूर करने के लिए घनत्व प्रवणता अतिकेंद्रीकरण (डीजी) का उपयोग उनके घनत्व के आधार पर बेहतर पृथक कणों के लिए किया जाता है। इस विधि को एक घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग कर के रूप में एक stepwise ढाल का उपयोग किया जाता है, जैसे iodixanol या sucrose, जो प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, और वायरस या वायरस की तरह कणों (VLPs) से EVs के जुदाई के लिए अनुमति देता है. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, जबकि यह एक बार सोचा था कि डीजी EV subpopulations के अधिक सटीक जुदाई के लिए अनुमति दी, अब यह ज्ञात है कि आकार और विभिन्न vesicles के घनत्व ओवरलैप कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक्सोसोम के पास 1.08-1.22 g/mL9का फ्लोटेशन घनत्व होता है, जबकि गोलगी (COPI+ या क्लथ्रिन+) से अलग किए गए vesicles में 1.05-1.12 g/mL और अंत:द्रव्यीय जालिका (COPI+ से अलग किया जाता है । ) तलछट 1.18-1.25ग्राम / इसके अतिरिक्त, यदि कोई वायरल कणों वाले अंशों के विरुद्ध एक्सोसोमल भिन्नों की तुलना करना चाहता है, तो यह ब्याज के वायरस के घनत्व के आधार पर अधिक कठिन हो सकता है-एचआईवी-1 के अलावा अन्य वायरस हैं जो संभवतः एक ही पर साम्य हैं घनत्व के रूप में exosomal सकारात्मक भिन्न2.
अंत में, बहाव दृश्य और कार्यात्मक परख के लिए EV preps के संवर्धन EV अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है. EV समृद्ध नैनोकणों का उपयोग, विशेष रूप से, बहु कार्यात्मक hydrogel कणों कि व्यास में 700-800 एनएम रेंज, केंद्रित EV preps को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम हैं. वे एक उच्च आत्मीयता खुशबूदार चारा जो चयन को बढ़ावा देने के लिए एक झरझरा बाहरी sieving खोल द्वारा encapsulated के अधिकारी. इस अध्ययन में उपयोग किए गए नैनोकणों में विभिन्न कोर चारा (रिएक्टिव रेड 120 NT80; और सिबाक्रोन ब्लू F3GA NT82) के साथ दो अलग-अलग तैयारी शामिल हैं, जो विभिन्न अभिकर्मकों और बायोफ्लूइड्स से ईवीएस पर कब्जा बढ़ाने के लिए दिखाए गए हैं (सामग्री की तालिका देखें) )6,10,11,12,13,14,15. कणों iodixanol भिन्न, सेल संस्कृति supernatant, साथ ही इस तरह के प्लाज्मा, सीरम, मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ (सीएसएफ), और मूत्र6,13 के रूप में रोगी biofluids सहित कई प्रारंभिक सामग्री से EVs के आसान संवर्धन प्रदान करते हैं .
यहाँ प्रस्तुत विधि कई प्रौद्योगिकियों के संयोजन के द्वारा वर्तमान EV शुद्धि तकनीक की दक्षता में सुधार; EV वर्षा, घनत्व ढाल ultracentrifugation, और कण पर कब्जा, कार्यप्रवाह को कारगर बनाने के लिए, नमूना आवश्यकताओं को कम करने, और सभी EV अनुसंधान में उपयोग के लिए एक अधिक समरूप EV नमूना प्राप्त करने के लिए उपज में वृद्धि. इस विधि EVs और वायरल संक्रमण के दौरान उनकी सामग्री की जांच में विशेष रूप से उपयोगी है के रूप में यह एक 0.22 डिग्री निस्पंदन कदम बड़े, अवांछित vesicles और VLPs और कुल EV जनसंख्या के जुदाई को प्रभावी ढंग से प्रभावी ढंग से घनत्व के आधार पर बाहर करने के लिए भी शामिल है virions से EVs को अलग.
Protocol
Representative Results
Discussion
रेखांकित विधि बढ़ाया EV उपज और अलगाव के लिए एक संयोजन दृष्टिकोण का उपयोग EVs से वायरस की जुदाई के लिए अनुमति देता है. प्रारंभिक सामग्री की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (यानी, सेल supernatant) वर्षा, डीजी जुदाई, और नैनोकण ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Kashanchi प्रयोगशाला, विशेष रूप से वेन कॉक्स के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान (एआई078859, एआई074410, एआई127351-01, एआई043894 और एनएस099029 से एफ.के.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1X) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14x89mm | Beckman Coulter | 344059 |
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