Denne undersøgelse beskriver klassisk hydrering ved hjælp af den tynde lipid film metode til nanoliposome præparat efterfulgt af nanopartikel karakterisering. En 47 kDa-hydrophilic og kugleformet protein, Tarin, er med succes indkapslet som en strategi for at forbedre stabiliteten, undgå hurtig clearance, og fremme kontrollerede frigivelse. Metoden kan tilpasses til hydrofobe molekyler indkapsling.
Liposome nanocapsules er blevet anvendt til mange formål i den farmaceutiske, kosmetiske og fødevareindustrien. Attributter af Liposomer omfatter deres biokompatibilitet, bionedbrydelighed, ikke-immunogenicitet, ikke-toksicitet, og evne til at indfange både hydrofile og hydrofobe forbindelser. Den klassiske hydrering af tynde lipid-film i et organisk opløsningsmiddel påføres heri som en teknik til indkapsling af Tarin, en plantelectin, i nanoliposomer. Nanoliposome størrelse, stabilitet, fastklemning effektivitet, og morfologiske karakterisering er beskrevet i detaljer. Nanoliposomer tilberedes ved hjælp af 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino (polyethylenglycol)-2000] (ammoniumsalt; (DSPE-MPEG 2000) og cholesterylhemisuccinat (CHEMS) som de vigtigste bestanddele. Lipider opløses først i chloroform for at opnå en tynd lipid-film, som efterfølgende rehydreres i ammoniumsulfat opløsning, der indeholder proteinet, der skal indesluttes og inkuberet natten over. Derefter anvendes sonikering og ekstruderingsteknikker til at generere nanodimensionerede af vesikler. Nanovesikles størrelse og polydispersitetsindeks bestemmes af dynamisk lysspredning, mens nanovesikel morfologi vurderes ved scanning af elektronmikroskopi. Entrapment effektivitet bestemmes af forholdet mellem mængden af uindkapslet protein til oprindelige mængde af oprindeligt indlæst protein. Homogene Liposomer opnås med en gennemsnitlig størrelse på 155 nm og polydispersitet indeksværdi af 0,168. Der opnås en høj virkningsgrad på 83%.
Antallet af undersøgelser, som undersøger effektive lægemiddel leveringssystemer, er steget i de seneste år. Men, begrænsninger såsom hurtig clearance, dårlig Biodistribution, og opløselighed ved fysiologisk pH og utilstrækkelig cellulær optagelse stadig nødt til at blive overgået. Brugen af nanosystemer er dukket op som de seneste fremskridt inden for kræft Therapeutics, anvendes til at øge den intracellulære koncentration af lægemidler inde kræftceller samtidig minimere toksicitet i raske celler. Desuden anvendes nanopartikler fra forskellige materialer (dvs. polymerer, dendrimere, Liposomer, vira, carbonnanorør og metaller som jernoxid og guld) for øjeblikket til at forstærke anticancer effekterne og reducere systemisk toksicitet1. Liposome nanocapsules i særdeleshed har været anvendt til mange formål i den farmaceutiske, kosmetiske og fødevareindustrien. I de seneste år, forskellige nutraceutical produkter såsom vitaminer, enzymer, og urteekstrakter er blevet formuleret ved hjælp af Liposom teknologi2.
Liposomer er sfæriske vesikler bestående af en eller flere koncentriske lipid-dobbeltlag, der spontant dannes ved spredningen af phospholipider i vandig medie3,4. De polære hoveder af Fosfolipiderne er placeret på de ydre og indre overflader af membranerne, i kontakt med det vandige miljø. I modsætning hertil danner fedtsyre kæder den hydrofobe kerne af membraner og beskyttes mod vand5. Nogle egenskaber af Liposomer, der gør dem attraktive medicin leveringssystemer omfatter deres biokompatibilitet, bionedbrydelighed, ikke-immunogenicitet, ikke-toksicitet, og evne til at indfange både hydrofile og hydrofobe forbindelser6.
Liposomer kan tilberedes ved hjælp af forskellige processer trin såsom agitation, sonikering, ekstrudering, lyofilisering, frysning, og optøning. Klassiske metoder omfatter reverse fase fordampning, solvent injektion, og rengøringsmiddel dialyse. Den mest anvendte metode er tynd lipid film hydrering, også kendt som bangham metode, som bruges til at opnå vesikulære-lipid former7,8,9,10,11. Lamellaritet (antallet af phospholipid bilayers) og partikelstørrelse er klassiske parametre, der anvendes til at karakterisere Liposomer som enten 1) af vesikler (ulvs), dannet af en unik phospholipid tolags og varierende i størrelse som følger: i) lille af vesikler (SUVs, ~ 0,02-0,20 μm), II) store af vesikler (luvs, ~ 0,2-1,0 μm), og III) Giant af vesikler (guvs, > 1 μm); eller 2) multilamellar vesikler (mlvs, > 0,1 μm)3,12. Vesikel størrelse er en vigtig parameter, når man overvejer til terapeutisk brug, såsom i kræftbehandling, i hvilke størrelser af < 200 Nm er ideelle til at give nanovesikler til at krydse endotel barrieren og nå tumor væv4.
Heri, indkapsling procedure efter den klassiske hydrering af en tynd lipid filmteknik7 blev beskrevet ved hjælp af Tarin, en plante lektin karakteriseret som et hydrofile glokulært protein13,14,15 . Nanosized vesikler er fremstillet ved at medtage sonikering og ekstrudering trin i den vigtigste teknik, hvilket resulterer i stabile liposomale nanovesikler med høj fastklemning effektivitet16.
Den protokol, der er beskrevet heri, blev testet af Correa et al.16 til indkaptningen af Tarin, en immunmodulerende og antitumoralsk lektin renset fra Colocasia Alaria22. Metodologien gav gode resultater og gav mulighed for at fremstilling af stabile nanoliposomer af passende størrelse til terapeutiske anvendelser. Formuleringen præsenterer kontrolleret frigivelse ved forskellige pH-niveauer under fysiologiske forhold. Det potenserer også Tarin farmakologiske egenskaber, såsom hæmning af humane glioblastoma U-87 MG og brystkræft MDA-MB-231 cellelinjer og stimulering af mus knoglemarvsceller. Den liposomale præparat udviste ingen toksiske virkninger i raske mus celler16.
Den klassiske metode, først beskrevet af bangham et al.7, giver mulighed for produktion af store multilamellar Liposom vesikler, heterogene i størrelse og form. Tilpasninger af denne metode, som rapporteret i nærværende undersøgelse, anvendes med succes ved at medtage yderligere trin såsom sonikering og ekstrudering gennem en 0,2 μm polycarbonat membran. Dette gør det muligt at fremstilling af en mere homogen dispersion med hensyn til størrelse i nanometer området16,23,24. For at sikre vellykkede resultater bør den indkapsling og liposomale formulering, der er beskrevet her, derfor følges nøje.
Nanoliposome sammensætning blev omhyggeligt udvalgt for at sikre dannelsen af en tolags membran med dope, MPEG 2000-dspe, og Chems som de vigtigste bestanddele. Disse er naturlige dyr membran tolags bestanddele og sidstnævnte kan give fluiditet til nanoliposome arkitektur, sikre bred anvendelse til bioaktive sammensatte levering i mennesker.
Nanoliposome pegylation er afgørende for at garantere Liposom struktur stabilitet. Fraværet af peg fører til størrelse udvidelse, en høj polydispersitet indeks, og lav fastklemning effektivitet. Optimale resultater kan opnås med dope som den vigtigste Liposom komponent. Men, dette er en høj pris phospholipid. De finansielle omkostninger ved nanoliposome produktion kan opnås ved at erstatte DOPE med andre lignende lipider som DOPC (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholin). Chems er et kolesterol molekyle, der naturligt findes i animalske cellemembraner, som ikke bør udelukkes fra formuleringen, da det er vigtigt at sikre lipidbilayer fluiditet og formbarhed16.
Andre aspekter af indkapsling protokollen kan også tilpasses. Den chloroform, der anvendes til at opløse liposomalkomponenterne, kan let udskiftes med methanol uden påvirkning af gennemsnittet, homogeniteten og effektiviteten af indhalingen. Der kan dog forekomme en vis protein lækage ved opbevaring under 4 °C16. Natten inkubations trinnet med ammoniumsulfat opløsning indeholdende Tarin er ikke obligatorisk; for nemheds skyld kan det dog udføres uden skader på nanoliposomale biofysiske egenskaber, indkapsling eller tab af stabilitets effektivitet, som det fremgår af Correa et al.16. Ekstruderingtrinet udføres ved stuetemperatur, hvilket kan nedsætte strømningshastigheden mellem sprøjterne, hvis der anvendes en pore størrelses membran på 0,1 μm.
For at løse dette problem bør det overvejes at anvende en pore størrelses membran på 0,2 μm eller opvarmning af ekstruder holderen over lipid-overgangs temperaturen. Analytikeren skal passe på ikke at beskadige lipiderne eller proteinet, der kan inaktiveres og miste biologisk aktivitet. Alternativt kan liposomal præparat dialyseres mod HBS i stedet for ultracentrifugering, ved hjælp af en cut-off membran i henhold til protein molekylvægt. Valget af den kemiske karakter af den buffer, hvori nanoliposomer suspenderes efter ultracentrifugering, er direkte relateret til den efterfølgende anvendelse. Da perspektiverne for denne undersøgelse omfatter in vivo og in vitro assays, suspension i HEPES Buffered saltvand var tilstrækkelig til at sikre ingen cytotoksiske virkninger og et pH-interval tæt på fysiologiske forhold.
Liposomer skal behandles fint, svarende til levende celler, for at opnå højere kvalitet SEM billeder. Fikserings-og tørre procedurer er vigtige for at sikre visualisering af mindre intakte vesikler, der under vakuum betingelser understøtter værdier på over 20 kV. Figur 2 A, B viser vesikler i nanostørrelse, der er kompatible med ekstruderingsproceduren. Visualisering af vesikler, der spænder fra 51-396 nm, er muligt, hvis der udføres tilstrækkelig prøveforberedelse efter denne procedure. Trinene omfatter fiksering, tørring ved at øge ethanol koncentrationer, og kemisk dehydreringen for at undgå dannelsen af aggregater og bristede vesikler forårsaget af vakuum og elektronstråle. På den anden side, figur 2C, D viser Liposom vesikler tørret under stuetemperatur og ikke udsættes for nogen behandlinger, der er beskrevet her, hvilket betyder, at de var forberedt utilstrækkeligt. Som følge af den utilstrækkelige procedure dannes der gigantiske vesikler, selv efter ekstrudering gennem en 0,2 μm pore størrelses membran. Der observeres også rupturerede vesikler i begge paneler som følge af vakuum-og elektronstråle skader.
Nanoliposome vesikler er blevet udforsket som et indkapsling og leveringssystem for hydrofobe molekyler, herunder resveratrol (3, 5, 4 ‘-trihydroxystilbene), en Bioaktiv forbindelse mod kolorektal cancerceller. Indkapsling proceduren kan overvinde den ringe Opløselighed af lipofile forbindelser ud over at give biokompatibilitet, bionedbrydelighed, ikke-immunogenicitet, og ikke-toksicitet egenskaber iboende til fedtstoffer nanocapsules25. Protokol tilpasninger skal tages i betragtning afhængigt af administrationsvej og formål, såsom udvikling af nye Liposom formuleringer til oral administration.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for COPPE/UFRJ, elektronisk mikroskopi laboratorium, og flerbruger materialer karakterisering laboratoriefaciliteter; til Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe og Rafael Lindoso, professorer i Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug for ultracentrifuge; til Dr. Alexandre Guedes Torres og Daniel Perrone, professorer ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug af rotationsfordamper; til professor Roland Bodmeier og Dr. Andriy Dashevskiy fra Freie Universität i Berlin, som hjalp med ressourcer, leverede nye metoder og overvågede ACNTF under et 6 måneders Erasmus + stipendium i Tyskland; til Dr. Rossana Thiré og Aline Fernandes, professor og tekniker ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug for Zetasizer Malvern; til Bluma Guenther og Taissa Rodrigues, professor og tekniker ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug for SEM; til Dr. Rachel Ann Hauser Davis, forsker ved Fundação Oswaldo Cruz, til fortælling. Denne undersøgelse blev delvis finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES)-Finans kode 001 (Grant nr. 1627392; 1811605); af Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant nr. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 og E-26/202.860/2016); af Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Grant nr. 406601/2018-6) og Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |