In vitro-analysen for å studere tumor-macrophage interaksjon

Summary

Denne artikkelen representerer en nyttig in vitro-analysen for å evaluere evnen til betinget medium fra tumorceller å tiltrekke makrofager.

Abstract

Tumor forbundet makrofager (TAMs) står for en stor prosentandel av cellene i tumor massen for ulike typer kreft. Glioblastom (GBM), en ondartet hjernesvulst uten kur, har opptil halvparten av tumor massen TAMs. TAMs kan være Pro-tumoral eller anti-tumoral, avhengig av aktivering av spesifikke gener i cellene. Genetiske mutasjoner i tumorer, gjennom regulering cytokin uttrykk, kan påvirke rekruttering av TAMs til tumor mikromiljøet. Her beskriver vi en kvantitativ celle-basert analyse for å vurdere macrophage rekruttering av betinget medium fra tumorceller. Denne analysen bruker den menneskelige macrophage cellelinje MV-4-11 for å studere macrophage attraksjon ved betinget medium fra glioblastom, noe som åpner for høy reproduserbarhet og lav variasjon. Data generert med denne analysen kan bidra til en bedre forståelse av samspillet mellom tumor og tumor mikromiljøet. Lignende analysen kan brukes til å vurdere samspillet mellom tumorceller og andre immunceller, inkludert T-celler og naturlig Killer (NK) celler.

Introduction

Makrofager er immunceller med høy fenotypiske og funksjonell heterogenitet¹. De spiller viktige roller i verts forsvaret systemer, reparasjon av vev, utvikling og tumorprogresjon¹. TAMs er makrofager i mikromiljøet av solide svulster. Visse TAMs kan fremme tumor vekst gjennom hemme T Cell-mediert cytotoksisk aktivitet, modulerende svulsten mikromiljøet (TME), fremme angiogenese, invasjon og metastasering^{2,3,4, 5}. TAMs er blant de mest tallrike celletyper i TME og høyere antall TAMs generelt samsvarer med verre pasient overlevelse i mange typer solide svulster⁶. De distinkte genetiske signaturene i tumorcellene påvirker deres evne til å rekruttere makrofager. I GBM, en aggressiv hjernesvulst uten kur, makrofager kan representere opptil halvparten av tumor massen⁷. Co-forsterkning av epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) og dens avkorting mutant EGFRvIII er ofte observert i GBM, som gir tumor vekst fordeler⁸. Celler co-uttrykker EGFR og EGFRvIII tiltrekke flere makrofager i forhold til celler som uttrykker EGFR eller EGFRvIII enkeltvis⁷.

Chemokiner er en familie av små cytokiner som spiller en betydelig rolle i å regulere immunforsvaret iTME. Menneskelige celler uttrykker mer enn 50 cytokiner¹⁰. Immun infiltrasjon i svulster er i stor grad realisert ved samspillet mellom cytokiner og cytokin reseptorer¹¹. Hver type immunceller uttrykker distinkte chemokine reseptorer/chemokiner og kan bli rekruttert av celler sekresjon spesifikke chemokiner/chemokine reseptorer¹². Kreftceller kan øke uttrykk for visse chemokiner å rekruttere immunceller som TAMs, regulatoriske T celler og myelogen Suppressor celler (MDSCs)⁶. Blokade av spesifikke chemokine skilles ut av svulster kan være en lovende måte i hemme infiltrasjon av immunceller i tumor massen.

Her beskriver vi en protokoll som tillater in vitro evaluering av tumor-macrophage interaksjon, ved hjelp av betinget Media fra tumorceller som inneholder chemokiner og macrophage cellelinjer.

Protocol

1. middels forberedelse Tilberedning av serum-fri stilk cellen medium Tin 50x B27-tillegget, den epidermal vekst faktoren (EGF, 20 μg/mL i 10 mM eddiksyre med 0,1% BSA), og Fibroblast vekstfaktor (FGF, 20 μg/mL i 10 mM eddiksyre med 0,1% BSA). Tilsett 500 μL av EGF (siste konsentrasjon 20 ng/mL), 500 μL av FGF (siste konsentrasjon 20 ng/mL), 10 mL 50x B27 til 500 mL av Dulbecco ‘ s modifiserte Eagle medium/næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F12) og 5 mL av 100% penicill…

Representative Results

Resultatene er vanligvis viste via bar grafer (eksempel vist i figur 1). Prøver med høye 480/520 verdier tyder på at mediene har høy kapasitet til å rekruttere makrofager. Avhengig av eksperimentell behov, kan flere kontroller inkluderes. For eksempel kan man bruke nøytralisere antistoffer for å behandle de conditioned Media å avskaffe macrophage chemotaxis, og utføre samme analysen. Man kan også legge til ekstra chemokiner (dvs. CCL2) til condition…

Discussion

I denne protokollen er det flere viktige trinn: 1) valg av Transwell innsats. For MV-4-11 cellelinje 5 μm Transwell setter fungerer godt. Men for andre cellelinjer som vanlig brukte monocytt cellelinje THP-1, kan en annen pore størrelse fungere bedre. 2) som forskjellige cellelinjer vokser i forskjellige hastigheter, er det viktig å justere volumet av de conditioned Media i henhold til celle tall. For dette formålet kan celle frie medier som er inkubert under de samme eksperimentelle forholdene, brukes til å fortynn…

Materials

0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021