In vitro-analys för att studera interaktion med tumör-makrofage

Summary

Denna artikel är en användbar in vitro-analys för att utvärdera förmågan hos konditionerade medium från tumörceller att locka makrofager.

Abstract

Tumör associerade makrofager (TAMs) står för en stor andel av celler i tumör massan för olika typer av cancer. Glioblastoma (GBM), en elakartad hjärntumör utan botemedel, har upp till en halv tumören massan TAMs. TAMs kan vara protumoral eller anti-tumoral, beroende på aktiveringen av specifika gener i cellerna. Genetiska mutationer i tumörer, genom att reglera cytokin uttryck, kan påverka rekryteringen av TAMs till tumören mikromiljö. Här beskriver vi en kvantitativ cell-baserad analys för att bedöma makrofagrekrytering av det konditionerade mediet från tumörcellerna. Denna analys använder mänskliga makrofage cellinjer MV-4-11 att studera makrofage attraktion av det konditionerade mediet från glioblastoma, möjliggör hög reproducerbarhet och låg variation. Data som genereras med denna analys kan bidra till en bättre förståelse av samspelet mellan tumören och tumören mikromiljö. Liknande analys kan användas för att bedöma samspelet mellan tumörceller och andra immunceller, inklusive T-celler och naturliga mördare (NK) celler.

Introduction

Makrofager är immunceller med hög fenotypisk och funktionell heterogenitet¹. De spelar viktiga roller i värd försvaret system, vävnad reparation, utveckling och tumör progression¹. TAMs är makrofager i mikromiljön av solida tumörer. Vissa Tams kan främja tumörtillväxt genom att hämma T cell-medierad cytotoxisk aktivitet, modulerande tumören mikromiljö (TME), främja angiogenes, invasion och metastaser^{2,3,4, 5}. Tams är bland de vanligast förekommande celltyperna i TME och högre antal Tams i allmänhet korrelerar med sämre patientens överlevnad i många typer av solida tumörer⁶. De distinkta genetiska signaturerna av tumörcellerna påverkar deras förmåga att rekrytera makrofager. I GBM, en aggressiv hjärntumör utan botemedel, makrofager kan representera upp till hälften av tumör massan⁷. Samtidig amplifiering av epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) och dess trunkering Mutant egfrviii observeras ofta i GBM, som ger tumörtillväxt fördelar⁸. Celler Co-uttrycker EGFR och EGFRvIII locka fler makrofager jämfört med celler som uttrycker EGFR eller EGFRvIII var för sig⁷.

Chemokines är en familj av små cytokiner som spelar betydande roller i regleringen av immun sammansättningen i TME^6,9. Humana celler uttrycker mer än 50 cytokiner¹⁰. Immun infiltration i tumörerna realiseras till stor del av samspelet mellan cytokiner och cytokin receptorer¹¹. Varje typ av immunceller uttrycker distinkta Chemokine receptorer/chemokines och kan rekryteras av celler utsöndring specifika chemokiner/Chemokine receptorer¹². Cancer celler kan öka uttrycket av vissa chemokines att rekrytera immunceller såsom TAMs, reglerande T-celler och myeloida-derived suppressor celler (MDSCs)⁶. Blockad av specifika Chemokine utsöndras av tumörerna kan vara ett lovande sätt att hämma infiltration av immunceller i tumör massan.

Här, vi beskriver ett protokoll som möjliggör in vitro-utvärdering av tumör-makrofaginteraktion, med hjälp av konditionerade medier från tumörceller som innehåller chemokiner och makrofage cellinjer.

Protocol

1. medelstora preparat Beredning av det serum fria stamcells mediet Tina 50x B27 tillägg, den Epidermal tillväxtfaktor (EGF, 20 μg/mL i 10 mM ättiksyra med 0,1% BSA), och fibroblast tillväxtfaktor (FGF, 20 μg/mL i 10 mM ättiksyra med 0,1% BSA). Tillsätt 500 μL av EGF (slutlig koncentration 20 ng/mL), 500 μL av FGF (slutlig koncentration 20 ng/mL), 10 mL 50x B27 till 500 mL av Dulbecco ‘ s modifierade Eagle medium/näringsämne blandning F-12 (DMEM/F12) och 5 mL 1…

Representative Results

Resultaten visas vanligtvis via stapeldiagram (exemplet visas i figur 1). Prover med höga 480/520 värden indikerar att de konditionerade medierna har hög kapacitet att rekrytera makrofager. Beroende på experimentellt behov kan ytterligare kontroller inkluderas. Till exempel kan man använda neutraliserande antikroppar för att behandla de konditionerade medierna att avskaffa makrofag chemotaxis, och utföra samma analys. Man kan också tillfoga extra chem…

Discussion

I det här protokollet finns det flera viktiga steg: 1) val av Transwell-insatsen. För MV-4-11 cell linjen, 5 μm Transwell skär fungerar bra. Men för andra cellinjer som vanligt förekommande monocyt cell linje THP-1, en annan porstorlek kan fungera bättre. 2) eftersom olika cellinjer växer i olika hastigheter, är det viktigt att justera volymen av de konditionerade medierna enligt cell nummer. För detta ändamål, cell-fria medier inkuberas under samma experimentella förhållanden kan användas för att späda …

Materials

0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021