تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)
Summary
هنا، نقدم بروتوكوللإثراء مواقع ربط الحمض النووي الريبي الذاتية أو “آثار أقدام” من RNA: البروتين (RNP) المجمعات من خلايا الثدييات. وينطوي هذا النهج على هطول يناهي الأمطار المناعية للوحدات الفرعية RNP، وبالتالي يطلق عليه اسم الترسيب المناعي للرنا جنبا إلى جنب (RIPiT).
Abstract
الحمض النووي الريبي المناعي الترسيب جنبا إلى جنب (RIPiT) هو وسيلة لإثراء آثار أقدام الحمض النووي الريبي من زوج من البروتينات داخل RNA: البروتين (RNP) مجمع. يستخدم RIPiT خطوتين تنقية. أولاً، يتبع الترسيب المناعي لوحدة فرعية RNP الموسومة هضم RNase معتدل وما يترتب على ذلك من عدم التنافر تقارب الإنحطاط. يسمح هطول الأمطار المناعي الثاني لوحدة فرعية أخرى RNP بإثراء مركب محدد. بعد إزالة التناطور من RNAs والبروتينات، يتم تحويل آثار أقدام الحمض النووي الريبي إلى مكتبات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية. على عكس الأشعة فوق البنفسجية الأكثر شعبية (UV) الربط المتصالب تليها المناعيةالتر (CLIP) نهج لإثراء مواقع الربط RBP، RIPiT هو الأشعة فوق البنفسجية crosslinking مستقلة. وبالتالي RIPiT يمكن تطبيقها على العديد من البروتينات الموجودة في interactome RNA وخارجها التي هي ضرورية لتنظيم RNA ولكن لا تتصل مباشرة الحمض النووي الريبي أو الأشعة فوق البنفسجية كروسلينك سيئة إلى RNA. توفر خطوتا التنقية في RIPiT ميزة إضافية لتحديد المواقع الملزمة التي يعمل فيها بروتين الاهتمام بالشراكة مع عامل مساعد آخر. كما تعمل استراتيجية التنقية المزدوجة على تعزيز الإشارة عن طريق الحد من الخلفية. هنا، نحن نقدم إجراء خطوة حكيمة لأداء RIPiT وتوليد مكتبات تسلسل عالية الإنتاجية من آثار أقدام RNA معزولة. كما نلخص مزايا وتطبيقات RIPiT ونناقش بعض قيودها.
Introduction
داخل الخلايا، يوجد الحمض النووي الريبي في مجمع مع البروتينات لتشكيل RNA: مجمعات البروتين (RNPs). يتم تجميع RNPs حول البروتينات الملزمة RNA (RBPs، تلك التي تربط مباشرة RNA) ولكن أيضا تتألف من غير RBPs (تلك التي تربط RBPs ولكن ليس RNA)، وغالبا ما تكون ديناميكية في الطبيعة. وتعمل الممارسات التجارية التقييدية وعواملها المساعدة بصورة جماعية في إطار الممارسات التجارية الوطنية من أجل تنفيذ الوظائف التنظيمية. على سبيل المثال، في مسار اضمحلال الحمض النووي الريبي (NMD) الذي يتم التوصل إلى هذا التسوس بوساطة هراء، تعترف بروتينات UPF (UPF1 وUPF2 وUPF3b) بالريبوسوم المنهي قبل الأوان. كل من البروتينات UPF يمكن ربط الحمض النووي الريبي، ولكن فقط عندما تجمع معا أن مجمع NMD نشط يبدأ في تشكيل. داخل هذا المجمع، يتم تنشيط UPF1 بشكل أكبر عن طريق الفسفورية من قبل SMG1 غير RBP، ومثل هذا التنشيط UPF1 يؤدي في نهاية المطاف إلى توظيف العوامل المسببة للاضمحلال mRNA1،2. وفي هذا المثال، تتطلب الممارسات التجارية التقييدية عوامل مساعدة غير من الممارسات التجارية التقييدية للتوظيف وتفعيل مجمع RNP الذي يؤدي إلى إجراء النُفِّم الوطني. ومع ذلك، فإن الخاصية الأخرى للـ RNPs هي عدم تجانسها التركيبي. النظر في spliceosome، الذي يوجد في المجمعات E أو A أو B أو C متميزة. المجمعات spliceosome مختلفة لديها البروتينات المتداخلة ومتميزة3. لدراسة وظائف RNP، من المهم توضيح أي RNAs ملزمة بالممارسات التجارية التقييدية والبروتينات المرتبطة بها. توجد العديد من الطرق لتحقيق ذلك، معكل نهج له مزاياه المميزة وعيوبه 4،5،6،7.
تعتمد الطرق الشائعة على نطاق واسع لتحديد مواقع ربط RBP — الربط المتبادل متبوعاً بالترسيب المناعي (CLIP) واختلافاته المختلفة – على الأشعة فوق البنفسجية (UV) للربط بين RBP وRNA8. غير أن هذا ليس نهجاً فعالاً للممارسات التجارية غير القائمة على النتائج في إطار الممارسات RNPs، التي لا تتصل مباشرة بالحمض النووي الريبي. وهنا، نوصف نهجاً بديلاً ينطبق على الممارسات التجارية التقييدية وغير الممارسات التجارية التقييدية على حد سواء، لعزل وتحديد مواقعها الملزمة بالحمض النووي الريبي. هذا النهج يسمى الحمض النووي الريبي المناعيالتر جنبا إلى جنب (RIPiT) يتكون من خطوتين منالي مناعي، والتي تساعد على تحقيق خصوصية أعلى بالمقارنة مع تنقية واحدة (الشكل 1)9،10. كما يمكن تنفيذ خطوات الترسيب المناعي الفردي (IP) في سلسلة أقل بالمقارنة مع CLIP، RIPiT لا يعتمد على توافر الأجسام المضادة التي يمكن أن تصمد أمام وجود المنظفات القوية أثناء الترسيب المناعي. الميزة الأكثر تفردا من RIPiT هو القدرة على استهداف اثنين من البروتينات المختلفة في خطوتين تنقية; وهذا يوفر وسيلة قوية لإثراء مجمع RNP متميزة تركيبيا من المجمعات المماثلة الأخرى11.
ويمكن للاختلافات الصغيرة في إجراء RIPiT أن تزيد من تعزيز إثراء RNP. على سبيل المثال، بعض تفاعلات الحمض النووي الريبي أو البروتين ية داخل RNPs عابرة وقد يكون من الصعب تنقية آثار أقدام مثل هذه المجمعات بكفاءة. لتثبيت هذه التفاعلات، يمكن ربط RNPs داخل الخلايا مع الفورمالديهايد قبل تحلل الخلايا وRIPiT. على سبيل المثال، لاحظنا أن التفاعل الضعيف بين عامل مجمع تقاطع exon (EJC) الأساسي، EIF4AIII وعامل التفكيك EJC، يمكن تثبيت PYM12 مع علاج الفورمالديهايد بحيث يتم إثراء المزيد من آثار الحمض النووي الريبي (البيانات لا يظهر). قبل حصاد الخلايا وRIPiT، يمكن أيضا أن تعامل الخلايا مع الأدوية لتحقيق الاستقرار أو إثراء RNPs في دولة معينة. على سبيل المثال، عند دراسة البروتينات التي تتم إزالتها من mRNA أثناء الترجمة (على سبيل المثال، EJC13، UPF114)، يمكن أن يؤدي العلاج مع مثبطات الترجمة مثل البوروميدسين أو السيكلوهيكسميد أو الهارينغتونين إلى زيادة شغل البروتينات على RNAs.
كمية الحمض النووي الريبي المستردة من RIPiT عادة ما تكون منخفضة (0.5-10 pmoles، أي 10-250 نانوغرام RNA النظر في متوسط طول RNA من 75 nt). السبب الرئيسي لهذا هو أن جزءا صغيرا فقط من بروتين معين موجود في مجمع مع البروتينات الأخرى داخل RNPs (يتم فقدان أي “حر” البروتين IP’ed في الخطوة الأولى خلال IP الثاني). لتوليد مكتبات RNA-Seq من هذا RNA، ونحن أيضا الخطوط العريضة هنا التكيف من بروتوكول نشرت سابقا مناسبة لمثل هذه المدخلات RNA منخفضة15،16 (الشكل2)، والتي تسفر عن عالية الإنتاجية تسلسل عينات جاهزة في 3 ايام.
Protocol
Representative Results
Discussion
نناقش هنا بعض الاعتبارات الرئيسية لتنفيذ RIPiT بنجاح. وقبل كل شيء، يجب تحسين الخطوات التقديمية الفردية لتحقيق أعلى كفاءة ممكنة في كل خطوة. وقد ثبت أن كمية الخرز agarose FLAG لعدد المدخلات من الخلايا الموصوفة هنا لتكون قوية لمجموعة واسعة من البروتينات التي اختبرناها. كما أن جزءا صغيرا فقط من البرو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة المعاهد القومية للصحة GM120209 (GS). يشكر المؤلفون ال [أوسوك] [جنوميكس] [كر] موارد مقدّمة لخدماته ([كّك] دعم منحة [نك] [ك] [ب30] [ك16058]).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
- Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
- Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
- Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
- Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).
- Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
- Konig, J., et al. iCLIP – Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
- Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
- Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
- Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
- Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
- Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
- Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
- Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3′ UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
- Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
- Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
- Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3′-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
- Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).
- Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).
