Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å berike endogene RNA bindende nettsteder eller “fotavtrykk” av RNA: protein (RNP) komplekser fra pattedyrceller. Denne tilnærmingen innebærer to immunoprecipitations av RNP under enheter og er derfor kalt RNA immunutfelling i tandem (RIPiT).
Abstract
RNA-immunutfelling i tandem (RIPiT) er en metode for å berike RNA-avtrykk av et par proteiner i et RNA: protein (RNP)-kompleks. RIPiT sysselsetter to rensing trinn. Først immunutfelling av en kodet RNP delenhet etterfølges av mild RNase fordøyelse og påfølgende ikke-denaturering affinitet eluering. En annen immunutfelling av et annet RNP delenhet tillater berikelse av et definert kompleks. Etter en denaturering eluering av RNAs og proteiner omdannes RNA-overføringene til biblioteker med høy gjennomstrømming for DNA-sekvenser. I motsetning til de mer populære ultrafiolette (UV) Cross Linking etterfulgt av immunutfelling (CLIP) tilnærming til å berike RBP bindende områder, er RIPiT UV-Cross Linking uavhengig. Derfor kan RIPiT brukes på en rekke proteiner som finnes i RNA-interactome, og utover det som er avgjørende for RNA-regulering, men ikke direkte kontakt RNA-eller UV-krysskobling dårlig til RNA. De to rensing trinnene i RIPiT gir en ekstra fordel av å identifisere bindende områder der et protein av interesse opptrer i samarbeid med en annen kofaktor. Den doble rensing strategien tjener også til å forbedre signalet ved å begrense bakgrunnen. Her gir vi en trinnvis fremgangsmåte for å utføre RIPiT og generere høy gjennomstrømming sekvensering biblioteker fra isolerte RNA fotavtrykk. Vi har også skissere RIPiT fordeler og programmer og diskutere noen av sine begrensninger.
Introduction
I cellene finnes RNA i komplekse med proteiner for å danne RNA: protein komplekser (RNPs). RNPs er satt sammen rundt RNA-bindende proteiner (RBPs, de som direkte binder RNA), men også består av ikke-RBPs (de som binder RBPs, men ikke RNA), og som ofte er dynamiske i naturen. RBPs og deres kofaktorer funksjon kollektivt innenfor RNPs å utføre regulatoriske funksjoner. For eksempel gjenkjenner UPF-proteinene (UPF1, UPF2 og UPF3b) den for tidlig avsluttet ribosom i den nonsense-mediert mRNA forfallet (NMD)-veien. Hvert av UPF-proteinene kan bindes til RNA, men det er først når de monterer sammen at et aktivt NMD-kompleks begynner å dannes. Innenfor dette komplekset blir UPF1 videre aktivert av fosforylering av en ikke-RBP SMG1, og slike UPF1 aktivisering fører til slutt til rekruttering av mRNA forfall inducing faktorer1,2. I dette eksempelet krever RBPs ikke-RBP kofaktorer for rekruttering og aktivering av RNP-komplekset som utløser NMD. Enda en eiendom av RNPs er deres heterogenitet. Vurder spliceosome, som finnes i distinkte E, A, B eller C komplekser. Ulike spliceosome komplekser har overlappende og distinkte proteiner3. For å studere RNP-funksjoner er det viktig å belyse hvilke RNAs som er bundet av en RBP og tilhørende proteiner. Mange metoder finnes for å oppnå dette, med hver tilnærming har sine distinkte fordeler og ulemper4,5,6,7.
Den allment populære metoder for å identifisere RBP bindende nettsteder-Cross Linking etterfulgt av immunutfelling (CLIP) og dens ulike variasjoner-stole på ultrafiolett (UV) lys for å krysskobling en RBP til RNA8. Dette er imidlertid ikke en effektiv tilnærming for ikke-RBPs innen RNPs, som ikke kontakter RNA direkte. Her beskriver vi en alternativ tilnærming som gjelder for både RBPs og ikke-RBPs, for å isolere og identifisere deres RNA bindende nettsteder. Denne tilnærmingen kalles RNA immunutfelling i tandem (RIPiT) består av to immunutfelling trinn, som bidrar til å oppnå høyere spesifisitet i forhold til en enkelt rensing (figur 1)9,10. Som individuelle immunutfelling (IP) trinnene kan utføres ved en lavere stringens i forhold til CLIP, RIPiT ikke avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer som tåler tilstedeværelsen av sterke vaskemidler under immunutfelling. Den mest unike fordelen med RIPiT er evnen til å målrette to forskjellige proteiner i to rensing trinn; Dette gir en effektiv måte å berike en sammensetningsmessig distinkt RNP kompleks fra andre lignende komplekser11.
Små variasjoner i RIPiT prosedyren kan ytterligere forsterke RNP berikelse. For eksempel, noen RNA-protein eller protein-protein interaksjoner innen RNPs er forbigående, og det kan være vanskelig å effektivt rense overføringene av slike komplekser. For å stabilisere slike interaksjoner, kan RNPs være krysskoblet i celler med formaldehyd før cellelyse og RIPiT. For eksempel har vi observert at en svak interaksjon mellom ekson Junction kompleks (EJC) kjerne faktor, EIF4AIII og EJC demontering faktor, PYM12 kan stabiliseres med formaldehyd behandling slik at mer RNA fotavtrykk er beriket (data ikke vises). Før celle høsting og RIPiT, celler kan også behandles med medikamenter for å stabilisere eller berike RNPs i en bestemt tilstand. For eksempel, når du studerer proteiner som er fjernet fra mRNA under oversettelsen (f. eks, EJC13, UPF114), behandling med oversettelse hemmere som puromycin, cycloheximide eller harringtonine kan føre til økt belegg av proteiner på RNAs.
Mengden av RNA utvinnes fra RIPiT er vanligvis lav (0,5-10 pmoles, dvs, 10-250 ng RNA vurderer en gjennomsnittlig RNA lengde på 75 NT). Den primære årsaken til dette er at bare en liten brøkdel av et gitt protein er til stede i komplekse med andre proteiner i RNPs (noen “gratis” protein IP’ed i første trinn er tapt under den andre IP). For å generere RNA-SEQ-bibliotekene fra denne RNA-en, skisserer vi også her en tilpasning av tidligere utgitte protokoll egnet for slike lave RNA-innganger15,16 (figur 2), som gir klare prøver med høy gjennomstrømming i 3 Dager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi diskuterer her noen viktige hensyn å kunne utføre RIPiT. Fremst må individuelle IP-adresser optimaliseres for å oppnå høyest mulig effektivitet på hvert trinn. Mengden av FLAG agarose perler for input antall celler som er beskrevet her har vist seg å være robust for et bredt spekter av proteiner vi har testet. Som bare en liten brøkdel av partner proteiner er co-immunoprecipitated med FLAGGET protein, er mengden av antistoff som trengs for effektiv andre IP vanligvis lav (mindre enn 10 μg). Småskala RIPiT …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant GM120209 (GS). Forfatterne takker OSUCCC Genomics delte ressurser Core for sine tjenester (CCC support Grant NCI P30 CA16058).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
- Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
- Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
- Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
- Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).
- Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
- Konig, J., et al. iCLIP – Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
- Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
- Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
- Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
- Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
- Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
- Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
- Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3′ UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
- Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
- Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
- Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3′-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
- Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).
- Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).
