अरबिडॉप्सिस डबल निषेचन में शुक्राणु परमाणु रूप विज्ञान अनुरेखण द्वारा निषेचन राज्य का मूल्यांकन
Summary
हम एक epifluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर Arabidopsis डबल निषेचन में शुक्राणु परमाणु आकृति विज्ञान के आधार पर सफल या असफल निषेचन निर्धारित करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन.
Abstract
फूल पौधों ‘डबल निषेचन’ कहा जाता है, जिसमें शुक्राणु कोशिकाओं में से प्रत्येक ठीक एक अंडा सेल या एक केंद्रीय सेल के साथ फ्यूज एक अद्वितीय यौन प्रजनन प्रणाली है। इस प्रकार, दो स्वतंत्र निषेचन की घटनाएं लगभग एक साथ होती हैं। निषेचित अंडा कोशिका और केंद्रीय कोशिका क्रमशः युग्मनज और एंडोस्पर्म में विकसित होती हैं। इसलिए, आगामी बीज विकास के लिए दोहरे निषेचन का सटीक नियंत्रण आवश्यक है। डबल निषेचन मादा युग्मोद्भिज (भ्रूण थैली) में होता है, जो गहराई से छिपा हुआ है और मोटी अंडाशय और अंडाशय के ऊतकों के साथ कवर किया जाता है। इस pistil ऊतक निर्माण अवलोकन और डबल निषेचन का विश्लेषण काफी मुश्किल बना देता है और वर्तमान स्थिति में डबल निषेचन के तंत्र के बारे में कई सवाल अनुत्तरित रह बनाया है. निषेचन नियामक के लिए एक संभावित उम्मीदवार के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए, निषेचन के phenotypic विश्लेषण महत्वपूर्ण है. Arabidopsis thalianaमें निषेचन के पूरा होने का न्याय करने के लिए, फ्लोरोसेंट संकेतों लेबलिंग शुक्राणु नाभिक के आकार संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है। एक शुक्राणु कोशिका जो निषेचित करने में विफल रहती है, मादा युग्मकों के बाहर एक संघनित फ्लोरोसेंट संकेत द्वारा इंगित की जाती है, जबकि एक शुक्राणु कोशिका जो सफलतापूर्वक निषेचित होती है, मादा युग्मक ों के साथ कर्मायोगी के कारण एक विसंधित संकेत द्वारा इंगित की जाती है। यहाँ वर्णित विधि vivo स्थितियों में सफल या विफल निषेचन निर्धारित करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
फूल वाले पौधे दोहरे निषेचन के माध्यम से बीजों का उत्पादन करते हैं, एक प्रक्रिया जो गेमेट प्लाज्मा झिल्ली1,2 पर स्थानीय प्रोटीनों के बीच बातचीत द्वारा सीधे नियंत्रित होतीहै. फूल संयंत्र पुरुष युग्मकों, शुक्राणु कोशिकाओं की एक जोड़ी, पराग में विकसित. परागण के बाद बढ़ता है कि मादा युग्मकों, एक अंडा कोशिका और एक केंद्रीय कोशिका है, जो एक भ्रूण थैली में विकसित करने के लिए शुक्राणु कोशिकाओं की एक जोड़ी बचाता है. पुरुष और महिला युग्मकों से मिलने के बाद, युग्मक सतह पर प्रोटीन डबल निषेचन को पूरा करने के लिए मान्यता, लगाव, और संलयन को बढ़ावा देते हैं। पिछले अध्ययनों में, पुरुष gamete झिल्ली प्रोटीन सामान्य सेल विशिष्ट 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 और GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 युग्मक संलयन में शामिल निषेचन नियामकों के रूप में पहचान की गई और अनुलग्नक, क्रमशः. हमने हाल ही में एक पुरुष युग्मक-विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन की पहचान की है, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), युग्मक बातचीत में शामिल एक निषेचन नियामक के रूप में. हमने पाया कि DMP9 अभिव्यक्ति की कमी के परिणामस्वरूप ए थालियाना6में डबल निषेचन के दौरान अंडे की कोशिका निषेचन में महत्वपूर्ण बाधा आती है.
के रूप में डबल निषेचन एक भ्रूण थैली में होता है, जो एक अंडाणु है कि आगे अंडाशय ऊतक के साथ लपेटा जाता है में एम्बेडेड है, यह निरीक्षण और डबल निषेचन प्रक्रियाओं की स्थिति का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है. इस कारण से, वहाँ अभी भी कई अस्पष्ट अंक है कि डबल निषेचन नियंत्रण के पूरे तंत्र की एक पूरी समझ में बाधा हैं. विवो परिस्थितियों में डबल निषेचन के दौरान युग्मकों के व्यवहार का पता लगाने के लिए अवलोकन तकनीकों की स्थापना निषेचन नियामकों के लिए संभावित उम्मीदवारों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अपरिहार्य है। हाल के अध्ययनों से मार्कर लाइनों जहां gamete subcellular संरचनाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल रहे हैं मिले हैं. इस लेख में, हम डबल निषेचन कि कृत्रिम रूप से परागण pistils से व्युत्पन्न एक भ्रूण थैली में हुई है अवलोकन के लिए एक सरल और त्वरित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. शुक्राणु कोशिका नाभिक मार्कर लाइन HTR10-mRFP7का उपयोग करना, प्रत्येक महिला युग्मक के निषेचन राज्य शुक्राणु परमाणु संकेत आकृति विज्ञान के आधार पर भेदभाव किया जा सकता है. निषेचन में शुक्राणु नाभिक के ऐसे रूपात्मक परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करने वाले हमारा प्रोटोकॉल सांख्यिकीय प्रमाण के लिए पर्याप्त मात्रा में डेटा प्राप्त कर सकता है। HTR10-mRFP पृष्ठभूमि के साथ एक DMP9-knockdownलाइन (DMP9KD/HTR10-mRFP) पुरुष पौधों के रूप में इस्तेमाल किया गया था एक एकल निषेचन पैटर्न दिखाने के लिए. प्रोटोकॉल अन्य निषेचन नियामकों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए भी उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP लेबल पैतृक क्रोमैटिन (यानी, शुक्राणु कोशिका नाभिक कल्पना), और डबल निषेचन में गतिशीलता7सूचित किया गया है. एक पराग ट्यूब से रिहाई के तुरंत बाद, HTR10-mRFP लेबल शुक्राणु नाभिक अभी भी संघनित कर रहे हैं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया था KAKENHI अनुदान (JP17H05832 से टी.आई.) और Phytochemical संयंत्र आणविक विज्ञान पर सामरिक प्राथमिकता अनुसंधान संवर्धन कार्यक्रम से वित्त पोषण द्वारा, चिबा विश्वविद्यालय (जापान).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
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