Evaluering av befruktning stat ved tracing sperm kjernefysisk morfologi i Arabidopsis dobbel befruktning
Summary
Vi viser en metode for å fastslå vellykket eller mislykket befruktning på grunnlag av sperm kjernefysisk morfologi i Arabidopsis dobbel befruktning ved hjelp av en epifluorescence mikroskop.
Abstract
Blomstrende planter har en unik seksuell reproduksjon system kalt “dobbel befruktning”, der hver av sperm cellene nøyaktig sikringer med en egg celle eller en sentral celle. Dermed vil to uavhengige befruktning hendelser skje nesten samtidig. Den befruktet egg celle og sentral celle utvikle seg til zygote og endosperm, henholdsvis. Derfor er presis kontroll av dobbel befruktning viktig for den påfølgende frø utvikling. Dobbel befruktning oppstår i den kvinnelige Gametofytt (embryo SAC), som er dypt skjult og dekket med tykt ovule og eggstokk vev. Dette pistil vev konstruksjonen gjør observasjon og analyse av dobbel befruktning ganske vanskelig og har skapt den nåværende situasjonen der mange spørsmål om mekanismen av dobbel befruktning forbli ubesvart. For funksjonell evaluering av en potensiell kandidat for befruktning regulator, er fenotypiske analyse av befruktning viktig. Å bedømme fullføringen av befruktning i Arabidopsis thaliana, formene av fluorescens signaler merking sperm kjerner brukes som indikatorer. En sperm cellen det svikter å gjødsle er indikert av en kondensert fluorescens signal ytterside av det kvinner kjønnscellene, mens derimot en sperm cellen det med hell fertilizes er angitt av en decondensed signal på grunn av karyogamy med det kvinner kjønnscellene ‘ kjernen. Metoden beskrevet her gir et verktøy for å fastslå vellykket eller mislykket befruktning under in vivo forhold.
Introduction
Blomstrende planter produsere frø gjennom dobbel befruktning, en prosess som er direkte styrt av interaksjoner mellom proteiner lokalisert på Kjønnscelle plasma membran1,2. Blomstrende plante mannlige kjønnscellene, et par sperm celler, utvikle seg i pollen. Et pollen rør som vokser etter pollinering leverer et par sperm celler til kvinnelige kjønnscellene, en egg celle og en sentral celle, som utvikler seg i et embryo SAC. Etter at den mannlige og kvinnelige kjønnscellene møtes, proteiner på Kjønnscelle overflaten fremme anerkjennelse, vedlegg og fusjon for å fullføre dobbel befruktning. I tidligere studier, den mannlige Kjønnscelle membran proteiner GENERATIVE celle spesifikke 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 og Kjønnscelle uttrykt 2 (GEX2)5 ble identifisert som befruktning regulatorer involvert i Kjønnscelle Fusion og vedlegg, henholdsvis. Vi har nylig identifisert en mannlig Kjønnscelle-spesifikt membran protein, DUF679 DOMAIN MEMBRAN PROTEIN 9 (DMP9), som en befruktning regulator involvert i Kjønnscelle interaksjon. Vi fant at en reduksjon på DMP9 uttrykk resulterer i betydelig hemming av egg celle befruktning under dobbel befruktning i a. thaliana6.
Som dobbel befruktning oppstår i et embryo SAC, som er innebygd i en ovule som er videre innpakket med eggstokk vev, er det vanskelig å observere og analysere statene dobbelt befruktning prosesser. Av denne grunn er det fortsatt mange uklare punkter som hindrer en fullstendig forståelse av hele mekanismen av dobbel befruktning kontroll. Etablering av observasjon teknikker for å spore atferden til kjønnscellene under dobbel befruktning under in vivo forhold er uunnværlig for funksjonell analyse av potensielle kandidater til befruktning regulatorer. Nyere studier har gitt markør linjer der Kjønnscelle subcellulære strukturer er merket med fluorescerende proteiner. I denne artikkelen viser vi en enkel og rask protokoll for å observere dobbel befruktning som har skjedd i et embryo SAC avledet fra kunstig pollinated pistils. Ved hjelp av sperm cellekjernen markør linje HTR10-mRFP7, befruktning tilstand av hver kvinnelige Kjønnscelle kan bli diskriminert på grunnlag av sperm kjernefysisk signal morfologi. Vår protokoll med fokus på en slik morfologiske endring av sperm kjerner ved befruktning kan effektivt få en tilstrekkelig mengde data for statistisk bevis. En DMP9-knockdown linje med HTR10-mRFP bakgrunn (DMP9KD/HTR10-mRFP) ble brukt som mannlige planter for å vise en enkelt befruktning mønster. Protokollen er også egnet for funksjonell analyse av andre befruktning regulatorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP etiketter fars kromatin (dvs. visualiserer sperm cellekjerner), og dynamikken i dobbel befruktning har blitt rapportert7. Umiddelbart etter løslatelse fra en pollen tube, HTR10-mRFP-merket sperm kjerner er fortsatt kondensert. Imidlertid er hver av sperm kjerner decondensed ved sammenslåing med en befruktet kvinnelig Kjønnscelle nucleus på karyogamy tre til fire timer etter Kjønnscelle membran Fusion7. Ubefruktede sperm celler forblir kondensert, som vist i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for fremme av science KAKENHI stipend (JP17H05832 til T. I.) og ved finansiering fra Strategic priority Research Promotion program på phytochemical Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japan).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
