Målet med protokollen er at illustrere de forskellige assays vedrørende viral Entry, der kan anvendes til at identificere de ansøske virale indgangs hæmmere.
Antiviral assays, der mekanisk undersøger viral indrejse er relevante for at skelne på hvilket trin de evaluerede agenter er mest effektive, og giver mulighed for identifikation af kandidat viral Entry hæmmere. Her præsenterer vi de eksperimentelle tilgange til identifikation af små molekyler i stand til at blokere infektion med den ikke-kappeklædte coxsackievirus A16 (CVA16) gennem målretning viruspartikler eller specifikke skridt i tidlig viral indrejse. Assays omfatter analyse af tidspunktet for lægemiddel tilsætning, flow cytometri-baseret viral bindings test og viral inaktiverings test. Vi præsenterer også en molekylær docking-protokol, der udnytter virus kapsid-proteiner til at forudsige potentielle rester, der er målrettet mod antivirale forbindelser. Disse analyser bør hjælpe i identifikationen af kandidat antivirale midler, der virker på viral indrejse. Fremtidige retninger kan udforske disse mulige hæmmere for yderligere narkotika udvikling.
Mund-, mund-og klovesyge (HFMD) er en sygdom, der oftest forårsages af coxsackievirus A16 (CVA16) og enterovirus 71 (EV71) hos små børn. For nylig i Asien-Stillehavsområdet har der været en betydelig stigning i CVA16-induceret HFMD. Mens symptomerne kan være milde, kan der opstå svære komplikationer, som påvirker hjernen og hjertet, med potentiel dødsfald1,2. På nuværende tidspunkt er der ingen licenserede antivirale behandlinger eller vaccinationer til rådighed for CVA16, og derfor er der et presserende behov for at udvikle antivirale strategier til at bremse fremtidige udbrud og de tilhørende komplikationer.
CVA16 er en ikke-kappeklædte virus, der har en icosahedral kapsid samlet fra pentamers, der hver indeholder 4 strukturelle proteiner, nemlig VP1, VP2, VP3, og VP4. Omkranser hver femdobling akse i pentamer kosmetisk er en ‘ Canyon ‘ region, der viser som en depression og er kendt for sin rolle i receptor binding3. I bunden af denne Canyon ligger en hydrofobe lomme i VP1-regionen, der indeholder en naturlig fed ligand, der hedder sphingosin (sph). Cellulære receptorer, såsom humant P molekylet glykoprotein ligand 1 (psgl-1) og Scavenger receptor klasse B-medlem 2 (SCARB2), er blevet foreslået til at spille en rolle i viral binding ved at forlede dette ligand, hvilket resulterer i konformationelle ændringer af kapsid og efterfølgende udslyngning af viral genom i værtscellen4,5,6. Identificering af mulige inhibitorer, der blokerer de successive hændelser i viral indrejse processen kunne give potentielle terapeutiske strategier mod CVA16 infektion.
Trinene i virus livscyklus kan dissekeret gennem eksperimentelle tilgange som mål for at hjælpe med at identificere mode-specifikke antivirale midler. En time-of-Drug-tilsætning analyse undersøger narkotikabehandling effekt på forskellige tidspunkter under virus infektion, herunder pre-Entry (tilføjet før virus infektion), indrejse (tilføjet samtidig med virus infektion), og post-Entry (tilføjet efter virus infektion)7. Virkningen kan vurderes ved hjælp af en standard plaque-analyse ved at kvantitere antallet af virale plaques dannet under hver af behandlingsbetingelserne. Den flowcytometri-baserede viral binding analyse afgør, om lægemidlet forhindrer viral fastgørelse til værtceller. Dette opnås ved at flytte temperaturen fra 37 °C, hvor størstedelen af menneskelige virusinfektioner forekommer, til 4 °C, hvor virions er i stand til at binde til værtscellens overflade, men er ude af stand til at komme ind i cellerne7. De celle membranbundne viruspartikler kvantificeres derefter ved immun farvning mod virale antigener og vurderes af flowcytometri. Viral inaktivering assay på den anden side hjælper med at vurdere potentielle fysiske interaktioner af lægemidlet med gratis viruspartikler, enten afskærmning eller neutralisering af virions, eller forårsager aggregeringer eller konformationelle ændringer, der gør dem inaktive for efterfølgende interaktioner med værtscellens overflade under infektionen8,9. I dette eksperiment er viral inokulum tilladt først at inkubere med lægemidlet, før det fortyndes for at titrere lægemidlet, inden det inficerer værtscellens enkeltlags og udfører en standard plaque-analyse8. Endelig er molekylær docking et effektivt værktøj til at forudsige potentielle lægemiddel interaktions steder på virion-overfladen, herunder de virale glykoproteiner fra kappeklædte vira og de virale kapsid-proteiner fra ikke-kappeklædte vira, ved hjælp af Computational Algoritmer. Dette hjælper til mekanisk at udpege mål for narkotika virkningsmekanisme og give nyttige oplysninger, der kan yderligere valideret af downstream analyser.
Vi har for nylig ansat de ovenfor beskrevne metoder til at identificere antiviral forbindelser, der effektivt blokeret infektion af ikke-kappeklædte CVA169. Heri beskrives og diskuteres de detaljerede protokoller, der blev brugt.
I denne rapport beskrev vi de protokoller, der er nyttige til identifikation af antivirale kandidater, der er målrettet mod viral indrejse, især i forhold til de ikke-kappeklædte CVA16. Assays er designet på måder at dissekere de tidlige hændelser under viral indrejse, hvilket er nyttigt at præcisere mekanismen (r) af handling og potentielle mål (r) af test agenternes antiviral aktivitet. “Time-of-Drug-tilsætning”-assay giver mulighed for bredt at bestemme det potentielle mål for test forbindelserne, for eksemp…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelig for Dr. Joshua Beckham på University of Texas i Austin for teknisk support med molekylær docking. Denne undersøgelse blev delvis støttet af finansiering fra det taiwanske videnskabs-og teknologiministerium (MOST107-2320-B-037-002 til C.-J.L. og L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 og MOST107-2320-B-038-034-MY3 til L.-T.L.).
4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
Corina | Molecular Networks GmbH | ||
Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
DMSO | Sigma | D5879 | |
FBS | GIBCO | 26140-079 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Graphpad Prism | GraphPad | ||
Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
PyMol | Schrödinger | ||
UCSF Chimera | University of California, San Francisco |