Utilisation des essais d'entrée virale et de l'analyse moléculaire de l'amarrage pour l'identification des candidats antiviraux contre le Coxsackievirus A16
Summary
L’objectif du protocole est d’illustrer les différents essais relatifs à l’entrée virale qui peuvent être utilisés pour identifier les inhibiteurs de l’entrée virale candidat.
Abstract
Les analyses antivirales qui examinent mécaniquement l’entrée virale sont pertinentes pour discerner à quelle étape les agents évalués sont les plus efficaces, et permettent l’identification des inhibiteurs d’entrée virales candidats. Ici, nous présentons les approches expérimentales pour l’identification de petites molécules capables de bloquer l’infection par le coxsackievirus A16 (CVA16) non enveloppé en ciblant les particules virales ou des étapes spécifiques dans l’entrée virale précoce. Les essais comprennent l’analyse de l’heure de l’ajout de médicaments, l’analyse de liaison virale basée sur la cytométrie du flux et l’essai d’inactivation virale. Nous présentons également un protocole d’amarrage moléculaire utilisant des protéines capsides virales pour prédire les résidus potentiels ciblés par les composés antiviraux. Ces tests devraient aider à l’identification des agents antiviraux candidats qui agissent sur l’entrée virale. Les orientations futures peuvent explorer ces inhibiteurs possibles pour le développement ultérieur de médicaments.
Introduction
La maladie de la main, du pied et de la bouche (HFMD) est une maladie la plus souvent causée par le coxsackievirus A16 (CVA16) et l’entérovirus 71 (EV71) chez les jeunes enfants. Récemment, dans toute la région Asie-Pacifique, il y a eu une hausse significative de la DHHC induite par le CVA16. Bien que les symptômes peuvent être légers, des complications graves peuvent se produire qui affectent le cerveau et le cœur, avec la fatalité potentielle1,2. À l’heure actuelle, il n’existe pas de thérapies antivirales ou de vaccins homologués pour le CVA16, et il est donc urgent d’élaborer des stratégies antivirales pour freiner les flambées futures et les complications connexes.
CVA16 est un virus non enveloppé qui a une capside icosahedral assemblé à partir de pentamers qui contiennent chacun 4 protéines structurelles à savoir VP1, VP2, VP3, et VP4. Encerclant chaque axe quintuple dans le phésse est une région «canyon» qui se manifeste comme une dépression et est connu pour son rôle dans la liaison des récepteurs3. Au fond de ce canyon se trouve une poche hydrophobe dans la région VP1 qui contient un ligand gras naturel nommé sphingosine (SPH). Les récepteurs cellulaires, tels que l’homme P selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) et le membre de classe B des récepteurs de charognards 2 (SCARB2), ont été suggérés pour jouer un rôle dans la liaison virale en déplaçant ce ligand qui a comme conséquence des changements conformationnels au capside et au éjection ultérieure du génome viral dans la cellule hôte4,5,6. L’identification des inhibiteurs possibles qui bloquent les événements successifs dans le processus d’entrée virale pourrait fournir des stratégies thérapeutiques potentielles contre l’infection de CVA16.
Les étapes du cycle de vie du virus peuvent être disséquées par des approches expérimentales comme cibles pour aider à identifier les agents antiviraux spécifiques au mode. Une analyse de l’heure d’ajout de médicaments examine l’effet du traitement médicamenteux à différents moments de l’infection virale, y compris la pré-entrée (ajoutée avant l’infection virale), l’entrée (ajoutée en même temps que l’infection virale) et après l’entrée (ajoutée après l’infection virus)7. L’impact peut être évalué à l’aide d’un analyse de plaque standard en quantiant le nombre de plaques virales formées dans chacune des conditions de traitement. L’essai de liaison virale basé sur la cytométrie du flux détermine si le médicament empêche l’attachement viral aux cellules hôtes. Ceci est réalisé en déplaçant la température de 37 oC, à laquelle la majorité des infections virales humaines se produisent, à 4 oC, où les virions sont capables de se lier à la surface de la cellule hôte, mais sont incapables d’entrer dans les cellules7. Les particules virales liées à la membrane cellulaire sont ensuite quantifiées par immunostaining contre les antigènes viraux et évaluées par cytométrie de flux. L’analyse d’inactivation virale, d’autre part, aide à évaluer les interactions physiques potentielles du médicament avec les particules virales libres, soit en protégeant ou en neutralisant les virions, ou en causant des agrégations ou des changements conformationnels qui les rendent inactifs pour interactions ultérieures avec la surface de la cellule hôte pendant l’infection8,9. Dans cette expérience, l’inoculum viral est autorisé à d’abord incuber avec le médicament avant d’être dilué pour titrer le médicament avant d’infecter la monocouche cellulaire hôte et d’effectuer un test de plaque standard8. Enfin, l’amarrage moléculaire est un outil puissant pour prédire les sites potentiels d’interaction médicamenteuse sur la surface de la virion, y compris les glycoprotéines virales des virus enveloppés et les protéines capsides virales des virus non enveloppés, en utilisant des Algorithmes. Cela permet de repérer mécanistement les cibles du mode d’action du médicament et de fournir des informations utiles qui peuvent être validées par des essais en aval.
Nous avons récemment utilisé les méthodes décrites ci-dessus pour identifier les composés antiviraux qui ont efficacement bloqué l’infection par le CVA169non enveloppé . Ici, les protocoles détaillés qui ont été utilisés sont décrits et discutés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce rapport, nous avons décrit les protocoles qui sont utiles pour l’identification des candidats antiviraux qui ciblent l’entrée virale, en particulier contre le CVA16 non enveloppé. Les essais sont conçus de manière à disséquer les premiers événements lors de l’entrée virale, ce qui est utile pour clarifier le mécanisme d’action et les cibles potentielles de l’activité antivirale des agents d’essai. L’« analyse de l’heure de l’ajout de médicaments » permet de déterminer de façon générale la cible…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants au Dr Joshua Beckham de l’Université du Texas à Austin pour son soutien technique avec l’amarrage moléculaire. Cette étude a été financée en partie par le financement du ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan (MOST107-2320-B-037-002 à C.-J.L. et L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 et MOST107-2320-B-038-034-MY3 à L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
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