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Medicine

Modelo de apendicectomía murine del cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica por localización precisa del parche de Caecal

Published: August 24, 2019
doi:
10.3791/59921
, , , , , , , , ,
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital,Xi’an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research,Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine,Xi’an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center,University of Health Network, 6Department of Pathology,Nanjing Medical University

Summary

El protocolo presentado describe una extirpación quirúrgica fácil del apéndice (parche cecaco) en un ratón seguido de la inducción del cáncer colorrectal asociado a la enfermedad inflamatoria intestinal. Este modelo de apendicectomía murina permite investigar el papel biológico del apéndice en la patogénesis de la enfermedad gastrointestinal humana.

Abstract

El apéndice humano ha sido implicado recientemente para desempeñar importantes papeles biológicos en la patogénesis de diversas enfermedades complejas, como el cáncer colorrectal, la enfermedad inflamatoria intestinal y la enfermedad de Parkinson. Para estudiar la función del apéndice, se ha establecido un modelo de apendicectomía murino asociado a la enfermedad intestinal y su protocolo paso a paso se describe aquí. Este informe introduce un protocolo fácil para la eliminación de parches de cecal en ratones seguido de la inducción química del cáncer colorrectal crónico asociado a la colitis utilizando una combinación de sulfato de dextran sódico (DSS) y azoximetano (AOM). Las células específicas de IgA y la concentración de IgA se redujeron significativamente tras la eliminación del parche ceaquídico en ratones machoC57BL/6 en comparación con los del grupo falso. La administración simultánea del 2% de DSS y AOM dio lugar a casi el 80% de supervivencia de ratones en grupos de farsa y apendicectomía sin pérdida significativa de peso corporal. Los resultados histológicos confirmaron la inflamación colónica y diferentes grados de adenocarcinoma. Este modelo se puede utilizar para el estudio del papel funcional del apéndice en el mantenimiento de la homeostasis de la microbiota intestinal y la patogénesis de la colitis intestinal y neoplasias malignas, así como para el desarrollo potencial de terapias de segmentación de fármacos.

Introduction

La apendicectomía clínica es un procedimiento quirúrgico estándar que implica la extirpación del apéndice principalmente debido a la inflamación (por ejemplo, apendicitis)1,2,3. Sin embargo, la función biológica del apéndice humano vermiforme sigue siendo controvertida4,5,6. El apéndice ha sido considerado como un remanente vestigial que se proyecta desde el cecum en el intestino grueso. Hasta hace poco, estudios evolutivos, inmunológicos, morfológicos y microbiológicos han sugerido que el apéndice puede poseer funciones distintas. Estas funciones incluyen la producción de inmunoglobinas (por ejemplo, IgA e IgG), una variedad de células B y células T críticas para respuestas inmunitarias adaptativas dentro de los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), y la reposición del intestino grueso con microbiotas comensales 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.

Los estudios epidemiológicos clínicos de pacientes con apendicectomía previa o apendicitis aguda también han revelado sus posibles funciones en la patogénesis de enfermedades humanas, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), el cáncer colorrectal y el (p. ej., enfermedad de Parkinson y enfermedad cardiovascular)13,14,15,16,17,18. Por ejemplo, un gran estudio de cohorte de población asiática con 75.979 pacientes con apendicectomía mostró recientemente una asociación significativa entre la apendicectomía y el desarrollo posterior del cáncer colorrectal, uno de los tumores malignos más comunes con una alta incidencia y mortalidad14,19. En consecuencia, establecer un modelo adecuado de apendicectomía animal que se asemeje a un ser humano será útil para investigar las funciones biológicas y los mecanismos moleculares del apéndice en la patogénesis de la enfermedad.

Muchos mamíferos poseen un órgano similar a un apéndice o apéndice, incluyendo primates, lagomorfos (por ejemplo, conejos), algunos roedores y marsupiales20. Para animales de laboratorio pequeños y de uso común, el conejo posee el apéndice vermiforme que se asemeja morfológicamente al humano21,22, pero GALT en el conejo es extremadamente grande en comparación con el de los seres humanos, ya que la mayoría de los los tejidos linfoides también se encuentran en los parches de Peyer ubicados en los intestinos pequeños y grandes21. Además, el conejo muestra una estructura folicular linfoide diferente, distribución de células T, y la densidad de inmunoglobulina del humano, lo que hace que el estudio de sus apéndices inapropiado21.

Los ratones son el modelo animal más utilizado para estudiar la fisiopatología humana y probar las diversas terápticas existentes y novedosas23,24,25. Se cree que el único racimo linfoide grande blanco en el ápice del caecum en ratones, conocido como parche cecaico, realiza funciones similares al apéndice humano26,27,28. Sin embargo, es prácticamente difícil separar el parche cecaico de caecum en ratones. Hasta ahora, los procedimientos quirúrgicos comunes para inducir la apendicitis en un modelo de ratón implican una incisión relativamente grande (por ejemplo, 1-2 cm) a través de la pared abdominal para tener acceso a todo el caecum (TablaSuplementaria 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Aquí, para generar un modelo de apendicectomía asociado con la enfermedad gastrointestinal, este informe presenta un protocolo quirúrgico fácil para la extracción de parches de ceca en ratones. Esto es seguido por la administración combinada del agente genotóxico AOM y el agente proinflamatorio DSS para la inducción de cáncer colorrectal asociado a la colitis similar al observado en humanos. La EII ha demostrado ser un factor de riesgo de cáncer intestinal37,38. La combinación de cáncer colorrectal crónico asociado a colitis crónica inducido por AOM/DSS ha sido bien establecida, y los lectores pueden referirse a Neufert et al., y Thaker et al. para procedimientos detallados39,40. Este modelo de apendicectomía murino reproducible y rápida se puede utilizar para estudiar la inflamación intestinal modulada por apéndice y la microbiota de colon, especialmente en el desarrollo y progresión de la EII y el cáncer colorrectal.

Protocol

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Xi’an Jiaotong (No. XJTULAC2019-1023). 1. Apendicectomía de ratones House 8–10-week-old C57BL/6 ratones macho en un ambiente certificado libre de patógenos específicos (SPF) durante 1 semana antes de la cirugía. Prepare los siguientes instrumentos quirúrgicos estériles: un par de microtijeras, un par de microfórptos, dos tamaños (4-0 y …

Representative Results

Establecimiento del modelo de apendicectomía murina Este modelo de apendicectomía murina de cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica se puede generar siguiendo los pasos quirúrgicos e inducción secuenciales como se ilustra en la Figura1. Las posiciones más frecuentes de caecum están en la fosa ilíaca izquierda y derecha seguida de la línea media del abdomen (Figura2). La tasa exitosa de prelocalizaci…

Discussion

Se obtuvo un modelo de apendicectomía murino de cáncer colorrectal asociado a la colitis mediante pasos quirúrgicos con una alta tasa de supervivencia en ratones. En la mayoría de los casos, dado que el caecum se colocó debajo de la pared abdominal (TablaSuplementaria 1, Tabla Suplementaria 2y Figura2), era difícil prejuzgar su ubicación sin laparotomía. En este protocolo quirúrgico, se introdujo un paso fácil de tocar el bache, y también se proporcionó una evalu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de los Fondos de Investigación Fundamental de la Universidad Central (G2018KY0302), el Fondo de Desarrollo de Investigación Fundamental Universitaria (KT00062), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81870380), y el Premio de Investigación Clínica de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi’an Jiaotong en China (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). Los autores agradecen al Dr. Chengxin Shi por sus sugerencias técnicas durante la fase de exploración temprana del modelo de apendicectomía murina, así como al patólogo Dr. Xi Liu por la evaluación de los resultados de tinción de H&E de colitis y tumores colorrectales. Y.L. realizó la demostración de cirugía, hizo análisis de datos y escribió el borrador del manuscrito; J.L., G.L., Z.P., y Y.M. participaron en la preparación quirúrgica, colecciones de tejidos y producción de video; M.Z. realizó la citometría de flujo y ELISA; Q.W. y H.X. proporcionaron el apoyo técnico para generar un modelo murino clínicamente relevante; R.X.Z. diseñó el estudio, supervisó la investigación y escribió y denitó el manuscrito; J.S. revisó el manuscrito.

Materials

Azoxymethane（AOM Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt（DSS MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050
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Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).
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