Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

Summary

Questo protocollo dimostra il rilevamento simultaneo di specie reattive dell’ossigeno (ROS), cellule vive e cellule morte nelle colture primarie vive da cellule superficiali del topo. 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate, iodio propidio e colorazione Hoechst sono utilizzati per valutare il ROS, le cellule morte e le cellule vive, seguita dall’imaging e dall’analisi.

Abstract

La superficie oculare è soggetta a usura regolare a causa di vari fattori ambientali. L’esposizione alle radiazioni UV-C costituisce un rischio per la salute sul lavoro. Qui, dimostriamo l’esposizione delle cellule staminali primarie dalla superficie oculare del topo alla radiazione UV-C. La formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) è la lettura dell’entità dello stress ossidativo/danno. In un ambiente sperimentale in vitro, è anche essenziale valutare la percentuale di cellule morte generate a causa dello stress ossidativo. In questo articolo, dimostreremo la colorazione 2’7′-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) delle cellule staminali staminali staminali oculari primarie esposte al topo UV-C e la loro quantificazione basata sulle immagini fluorescenti della colorazione DCFDA. DCFDA colorazione corrisponde direttamente alla generazione ROS. Dimostriamo anche la quantificazione delle cellule morte e vive colorando simultaneamente con iodide propidio (PI) e Hoechst 3332 rispettivamente e la percentuale di cellule dCFDA (ROS positivo) e PI positive.

Introduction

La superficie oculare (OS) è un’unità funzionale composta principalmente dallo strato esterno e dall’epitelio ghiandolare della cornea, dalla ghiandola lacrimale, dalla ghiandola meibomiana, dalla congiuntiva, parte dei margini del coperchio degli occhi e dalle innervazioni che traducono i segnali¹. Lo strato corneale a forma di cupola trasparente concentra la luce sulla retina. Questo tessuto avascolare è composto da componenti cellulari come cellule epiteliali, cherataciti, e cellule endoteliali e componenti acellulari come collagene e glicosaminoglycani². L’area è prosciugata da lacrime che forniscono anche la maggior parte dei nutrienti. La posizione anatomica dell’OS costringe ad essere a diretto contatto con l’ambiente esterno, spesso esponendolo a vari componenti duri come luce intensa, microbi, particelle di polvere e sostanze chimiche. Questo fattore predispone il sistema operativo alle lesioni fisiche e lo rende incline a varie malattie.

Lo stress ossidativo è causato dallo squilibrio tra la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e i meccanismi di difesa antiossidante endogene³. I ROS sono classificati in molecole reattive e radicali liberi, entrambi derivati dall’ossigeno molecolare (O₂₎attraverso il fosforilazione ossidativa mitocondriale⁴. Il primo gruppo è composto da specie non radicali come il perossido di idrogeno (H₂O_2),l’ossigeno singlet (¹O₂) e il secondo comprende specie come gli anioni di superossido (O₂^–), e i radicali idrossili (^,OH), tra gli altri. Queste molecole sono sottoprodotti di normali processi cellulari e i loro ruoli sono stati implicati in importanti funzioni fisiologiche come la trasduzione del segnale, l’espressione genica e la difesa ospite^{5 .} Una maggiore produzione di ROS è nota per essere generata in risposta a fattori come l’invasione di agenti patogeni, xenobiotici, e l’esposizione alla radiazione ultravioletta (UV)⁴. Questa sovrapproduzione di ROS provoca stress ossidativo che porta al danno di molecole come acidi nucleici, proteine e lipidi⁶.

La luce solare naturale, la fonte più predominante di radiazioni UV, è composta da UV-A (400-320 nm), UV-B (320–290 nm) e UV-C (290-200 nm)⁷. È stata riportata una correlazione inversa tra la lunghezza d’onda e le energie spettrali. Sebbene le radiazioni UV-C naturali siano assorbite dall’atmosfera, fonti artificiali come lampade a mercurio e strumenti di saldatura emettono e, quindi, costituiscono un pericolo professionale. I sintomi dell’esposizione agli occhi includono fotokeratite e fotokeratoconjunctivitis⁸. La produzione di ROS è uno dei principali meccanismi di infliggere danni cellulari indotti da UV⁹. Nello studio attuale, dimostriamo il rilevamento di ROS utilizzando il metodo di colorazione dedace (DCFDA) 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) nelle cellule superficiali del topo/cellule staminali esposte ai raggi UV-C. La fluorescenza verde è stata catturata utilizzando la microscopia fluorescente. Le cellule erano contro-macchiate con due coloranti, Hoechst 33342 e ioodio propidio rosso, per macchiare le cellule vive e morte, rispettivamente.

Protocol

L’esperimento è stato effettuato su cellule oculari primarie/cellule staminali derivate dall’occhio del topo albino svizzero. L’uso di animali per la raccolta degli occhi per questo esperimento è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali, Yenepoya (considerata Università) (numero di approvazione IEAC, 6a/19.10.2016). 1. Preparazione dei reagenti NOTA: la derivazione delle cellule primarie/cellule staminali dalla superficie oculare del topo esul…

Representative Results

DCFDA è un colorante incolore che è una forma chimicamente ridotta di fluoresceina utilizzata come indicatore per rilevare ROS nelle cellule. Questo coloranti rimane intrappolato all’interno delle cellule ed è facilmente ossidato alla diclorodicafluoresceina (DCF), che emette una fluorescenza verde. Questa fluorescenza può essere rilevata utilizzando la microscopia fluorescente. Le cellule possono essere visualizzate e correlate con l’accumulo di ROS come segue: (i) cellule vive senza ROS emettono alta fluorescenza b…

Discussion

Il metodo di colorazione DCFDA descritto qui consente la visualizzazione di ROS nelle cellule vive oculari primarie del topo trattate con radiazione UV-C. Un vantaggio di questo metodo di colorazione è che permette anche ai ricercatori di studiare gli effetti immediati dell’UV-C (3 ore dopo l’esposizione ALL’UVC) sulle cellule vive e la loro enumerazione simultanea per la percentuale di ROS positivi, così come le cellule morte. Inoltre, poiché il metodo di colorazione viene utilizzato sulle cellule vive, le cellule po…

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad