Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC50, l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside
Summary
Des essais d’activité basés sur la RMN ont été développés pour identifier et caractériser les inhibiteurs de deux enzymes nucléoside de ribohydrolase. Des protocoles sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d’E. coli.
Abstract
La spectroscopie RMN est souvent utilisée pour l’identification et la caractérisation des inhibiteurs des enzymes dans la découverte de médicaments, en particulier dans le contexte du dépistage des fragments. Les essais d’activité basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d’essai nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans une expérience rmN peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d’essai. Cela contraste avec les essais spectrophotométriques, dans lesquels les problèmes d’interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d’absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu’ils manquent d’enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet attribut les rend utiles en tant qu’essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage sur le banc. Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d’E. coli. Les méthodes sont démontrées à l’aide de deux enzymes de ribohydrolase nucléoside. L’utilisation de 1H NMR est montrée pour l’enzyme purine-spécifique, alors que 19NMR de F est montrée pour l’enzyme pyrimidine-spécifique. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme où les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Pour être le plus utile dans le contexte de la découverte de médicaments, la concentration finale de substrat ne doit pas être plus de 2-3x sa valeur Km. Le choix de l’expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l’instrumentation RMN disponible.
Introduction
La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est bien établie pour caractériser et surveiller les réactions enzymatiques1,2. Les différences dans les changements chimiques et les modèles d’accouplement sont utilisées pour distinguer les résonances du substrat et du produit, et des intensités de résonance relative sont utilisées pour quantifier le pourcentage de la réaction. La consommation de substrat et la création de produits sont directement observées dans le spectre de la RMN. Cela contraste avec la spectrophotométrie ou la spectroscopie fluorescence, dans laquelle le cours du temps de réaction est indiqué par un changement d’absorption attribuable à certaines espèces chimiques consommées ou créées. Tout comme avec les autres méthodes, la RMN peut être utilisée pour étudier les réactions enzymatiques en fonction de la température, du pH ou d’autres conditions de solution, et les effets des inhibiteurs peuvent être déterminés.
Plus récemment, des tests d’activité enzymatiques à base de RMN ont été démontrés pour le dépistage des fragments3,4. Les essais basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d’essai (souvent aussi élevés que 1 mM) nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans l’expérience rmnpeut peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d’essai. Cela se compare favorablement aux essais spectrophotométriques où les problèmes d’interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d’absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu’ils manquent d’enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet avantage les rend utiles comme essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage de banc5.
Dans notre laboratoire de recherche, des essais d’activité basés sur la RMN sont utilisés pour identifier et évaluer les inhibiteurs des ribohydrolases nucléoside de Trichomonas vaginalis. Le parasite T. vaginalis cause la maladie sexuellement transmissible non virale la plus répandue6. L’augmentation de la résistance aux thérapies existantes7 est à l’origine de la nécessité de nouveaux traitements basés sur des mécanismes, avec des enzymes essentielles de voie de récupération nucléoside représentant des cibles de premier plan8. Des essais d’activité basés sur la RMN ont été développés pour les enzymes spécifiques à la pyrimidine et à la purine, la ribohydrolase nucléoside d’uridine (UNH)9, et l’adénosine/guanosine préférant la ribohydrolase nucléoside (AGNH)10. Les réactions catalysées par ces deux enzymes sont montrées dans la figure 1. Les essais de RMN sont utilisés pour dépister les bibliothèques de fragments à la recherche de points de départ chimiques, déterminer les valeurs de l’IC50 et éliminer les inhibiteurs de liaison à base d’agrégation ou covalents11. Les mêmes essais sont également traduits pour évaluer l’activité enzymatique dans les cellules entières12.
Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d’E. coli. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme dans laquelle les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Trois hypothèses ont été faites pour la simplicité. Tout d’abord, le substrat n’est pas spécifié. Pour que les essais d’activité basés sur la RMN soient utiles, la concentration finale du substrat ne devrait pas dépasser 2-3x la valeur Km 4. Dans les exemples montrés, les concentrations finales d’adénosine et defluorouridine 5 sont de 100 M (Km 54 ‘M) et de 50 ‘M (Km ’15 ‘M), respectivement. Dans les protocoles, la réalisation de ces concentrations correspond à 12 l de 5 mM d’adénosine ou 12 à L de 2,5 mM 5-fluorouridine.
Deuxièmement, la quantité d’enzyme prévue dans les protocoles, 5 L, a été choisie pour correspondre à la quantité requise pour entraîner une conversion d’environ 75 % du substrat en produit en 30 min. Cette quantité représente généralement une dilution importante à partir d’un stock d’enzymes purifiées, et la dilution doit être déterminée à l’avance pour chaque enzyme. Les solutions de stock d’enzymes AGNH et UNH purifiées sont stockées à -80 oC dans des aliquots qui fournissent suffisamment d’enzymes pour plusieurs milliers de réactions. Ainsi, le facteur de dilution ne doit idéalement être déterminé ou validé que tous les quelques mois. Troisièmement, l’expérience spécifique 1D NMR n’est pas spécifiée. Dans les résultats représentatifs, 1H NMR est montré pour AGNH10 et 19F NMR est montré pour UNH9, avec l’expérience RmN décrite dans les références correspondantes. Le choix de l’expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l’instrumentation RMN disponible. Enfin, il convient de souligner que l’approche expérimentale décrite ne respecte pas les exigences strictes de la RMN quantitative (RMQ)13,14. Dans le protocole, une réaction en pourcentage est déterminée en utilisant les changements relatifs de l’intensité de la même résonance dans chaque spectre, plutôt qu’en déterminant les concentrations absolues. Cette approche élimine le besoin de modifications à l’acquisition et au traitement des données ainsi que des normes internes ou externes, qui sont requises pour le MRQ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits s’appliquent généralement à de nombreuses enzymes, à condition que les substrats et/ou les produits aient des signaux résolvables dans le spectre de la RMN. Cependant, il est essentiel que la concentration de substrat soit proche de sa valeur Km et suffisamment élevée pour être détectée dans une expérience de RMN dans un délai raisonnable. Une concentration de substrat ne s’est pas supérieure à 2-3x la valeur de Km est optimale pour détecter l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Dean Brown d’avoir fourni des composés de la bibliothèque de fragments d’AstraZeneca et le Dr David Parkin d’avoir fourni les enzymes AGNH et UNH. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases des National Institutes of Health sous le numéro de prix R15AI128585 à B. J. S. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.Research a également été soutenu par une bourse de recherche d’été Horace G. McDonell décernée à S. N. M., une famille Landesberg Bourse décernée à J. A. G., subventions de perfectionnement du corps professoral et prix de recherche Frederick Bettelheim de l’Université Adelphi à B. J. S.
Materials
| AGNH | Purified in-house | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purified in-house | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
| Dimethyl sulfoxide-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Deuterium oxide | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Conical tubes | Corning | 352099 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR tubes | Norell | 502-7 | Or as appropriate for the NMR |
| NMR spectrometer | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
| Prism software | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
References
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