Method Article

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

DOI:

10.3791/59949

⸱

December 17th, 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.

Abstract

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입양 면역 요법은 암과 전염병의 치료에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 우리는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 가진 1 차적인 인간 T 세포를 변환하고 그들의 자손 ex vivo를 확장하는 간단한 접근을 기술합니다. 우리는 CAR 발현뿐만 아니라 분화, 증식 능력 및 세포 분석 활성을 측정하는 분석방법을 포함한다. 우리는 CAR T 세포에서 이펙터 사이토카인 생산 및 염증성 사이토카인 분비를 측정하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 입양 면역 요법의 전임상 모형을 위한 CAR T 세포를 배양하기 위하여 믿을 수 있고 포괄적인 방법을 제공합니다.

Introduction

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키메라 항원 수용체 (CA)는 명백한 종양 항원에 대하여 T 세포를 리디렉션하는 유망한 접근을 제공합니다. CAR은 항원 표적을 결합하는 합성 수용체입니다. 정확한 컴포지션은 가변이지만 CA는 일반적으로 3개의 고유한 도메인을 포함합니다. 세포외 도메인은 표적 항원과 결합하는 것을 지시하며 전형적으로 세포외 힌지를 통해 CAR에 연결된 단일 사슬 항체 단편으로 구성된다. 제2 도메인은, 일반적으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 CD3θ 사슬로부터 유래되고, CAR 결합 후 T 세포 활성화를 촉진한다. 세 번째 costimultory 도메인 T 세포 기능을 향상 시키기 위해 포함, 생착, 물질 대사, 그리고 지 속성. B세포 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 다발성 골수종을 포함한 다양한 조혈 악성종양에서 CAR T 세포 치료의 성공은 이 접근법의 치료 적 약속을강조한다 1,2,3,4,5,6. 최근 식품의약국....

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Protocol

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모든 동물 연구는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인됩니다.

1. T 세포 활성화, 전이 및 확장

  1. 6웰 세포 배양 요리에서 T 세포당 3개의 비드의 비율로 안티 CD3/CD28 자기 비드(예를 들어, 다이나비드)와 혼합하여 신선하거나 냉동 보존된 1차 인간 T 세포를 활성화합니다. X-VIVO 15 배지에서 배양 T 세포는 5% 정상 인간 AB 혈청, 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES 및 IL2 (100 단위/mL)로 보충하였다. 팽창 하는 동안 106 T 세포/mL의 농도에서 T 세포를 유지 합니다. 배양 T 세포는 37°C, 20%O2,및 95% 습도에서 5%CO2를가진.
  2. 하룻밤 자극 후, 활성화 된 T 세포에 렌티 바이러스 상류제를 추가합니다. 3−5의 감염(MOI)의 복합성을 달성하는 데 필요한 상급체의 부피를 계산합니다.
    참고: CD19-BBθ CAR 렌티바이러스 플라스미드는 CD8 힌지, 4-1BB 코스티뮬레이션 도메인 및 CD3θ 신호도메인(21)으로구성된다. CD19-BBθ 렌티바이러스 상월제는 앞서 설명한 바와 같이 생....

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Results

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전술한 방법을 사용하여, 우리는 3 일 또는 9 일 동안 T 세포를 자극하고 확장하였다(도 1A,B). 우리는 또한 세포 표면에 표현된 명백한 당단백질의 풍부를 측정하여, 그림 1C에설명된 게이팅 전략에 의해 지시된 바와 같이 그들의 분화 단면도를 분석했습니다. 우리는 생체 배양 동안 시간이 지남에 따라 이펙터 분화를 향한 점진적인 변화를보여준다(도 1D). 우리는 항원반응으로 CAR T 세포의 이펙터 기능 및 증식 능력을 평가했습니다. 우리는 더 적은 (이전에 수확된) 확장된 세포가 더 긴 기간 동안 광범위하게 배양된 세포에 비해 기능적으로 우수했다는 것을 보여준다. 3일째 CART19 세포는 9일째에 비해 동조 리간드를 사용하여 재자극시 증식 및 세포용해 능력을 향상시켰습니다(.......

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Discussion

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여기에서 우리는 ex vivo 배양전반에 걸쳐 다양한 간격으로 수확된 CAR T 세포의 기능 및 효능을 측정하는 접근법을 기술한다. 우리의 방법은 시험관내 이펙터 기능뿐만 아니라 증식 능력을 평가하기 위해 고안된 계산에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 CAR를 통해 자극 다음 CAR T 세포 활동을 측정하는 방법을 설명하고 그들의 로그 방출 단계의 3 대 9 일째에 수확 된 CAR T 세포를 사용하여 백혈병의 세부 이종이식 모델.

생체 내 확장 동안 다른 시점에서 수확된 CAR T 세포의 효능을 비교하는 데는 내재된 과제가 있습니다. 3일 배양 기간 동안 생성된 T 세포의 양이 낮기 때문에, 기능의 포괄적인 평가를 수행하기에 부족한 숫자가 있을 수 있다. 이것은 그의 증식 능력이 외인성 및 본질적인 요인20때문에 수시로 감소되는 참을성 있는 T 세포의 맥락에서 악화됩니다.

얼마.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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이 작품은 펜실베니아 대학과 연구 동맹을 통해 노바티스 제약에 의해 제공 된 자금을 통해 부분적으로 지원되었다 (마이클 C. 밀론) 뿐만 아니라 세인트 볼드릭의 재단 학자 상 (사바 가세미).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
안티 CD3/CD28 다이나비드Thermo Fisher40203D
APC 마우스 안티 휴먼 CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 마우스 안티 휴먼 CD8 항체BD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS 용해 용액 10X 농축BD Biosciences349202
BD Trucount 절대 계수 튜브BD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 AntibodyBioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 AntibodyBioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE 세포 증식 키트Life TechnolohgiesC34554
CountBright 절대 계수 비드,InvitrogenC36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) 항체BD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Human AB serumValley BiomedicalHP1022
Human IL-2 IS, 프리미엄 등급Miltenyi130-097-744
L-글루타민Gibco28030-081
액체 섬광 계수기, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD 고정 가능한 바이올렛분자 프로브L34964
멀티사이저 쿨터 카운터Beckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific 블루 안티 휴먼 CD14 항체BioLegend325616RRID : AB_830689
퍼시픽 블루 안티 휴먼 CD19 항체BioLegend302223
PE 안티 휴먼 CD45RO 항체BD Biosciences555493RRID : AB_395884
PE / Cy5 안티 휴먼 CD95 (Fas) 항체BioLegend305610RRID : AB_493652
PE / Cy7 안티 휴먼 CD27 항체Beckman CoulterA54823
페놀 무함유 매체Gibco10373-017
UltraPure SDS 솔루션, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ SaltPerkin Elmer122799

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).
  2. Grupp, S. A., et al.

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CAR T CellsT Cell ExpansionLentiviral TransductionFlow CytometryCytokine SecretionCytolytic ActivityX Vivo 15 MediumAnti CD3 CD28 BeadsCryopreservation ProtocolEffector Differentiation

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