Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.
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Artigo de método
Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imunoterapia adotiva é promissora para o tratamento do câncer e das doenças infecciosas. Descrevemos uma abordagem simples para transduzir as células T humanas primárias com receptor de antígeno quimérico (CAR) e expandir sua progênie ex vivo. Incluímos ensaios para medir a expressão do CAR, bem como diferenciação, capacidade proliferativa e atividade citolítica. Descrevemos ensaios para medir a produção de citocina efetoee e secreção inflamatória de citocina em células T CAR. Nossa abordagem fornece um método confiável e abrangente para a cultura das células T CAR para modelos pré-clínicos de imunoterapia adotiva.
Introdução
Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) fornecem uma abordagem promissora para redirecionar as células T contra antígenos tumorais distintos. Cars são receptores sintéticos que ligam um alvo de antígeno. Embora sua composição precisa seja variável, os CARs geralmente contêm 3 domínios distintos. O domínio extracelular direciona a ligação a um antígeno alvo e normalmente é composto por um único fragmento de anticorpo de cadeia ligado ao CAR através de uma dobradiça extracelular. O segundo domínio, comumente derivado da cadeia CD3 do complexo do receptor de células T (TCR), promove a ativação de células T após o engajamento da RCA. Um terceiro domínio costimulatory....
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Protocolo
Todos os estudos em animais são aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade da Pensilvânia.
1. Ativação de células T, transdução e expansão
- Ativar células T humanas primárias frescas ou criopreservadas misturando-se com contas magnéticas anti CD3/CD28 (por exemplo, dynabeads) a uma proporção de 3 contas por célula T em pratos de cultura celular de 6 poços. Células T culturais no X-VIVO 15 médias complementadas com 5% de soro ab humano normal, 2 mM L-glutamina, 20 mM HEPES e IL2 (100 unidades/mL). Mantenha as células T em uma concentração de 106 células T/mL durante a expansão. Células T cu....
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Resultados
Usando os métodos descritos acima, estimulamos e expandimos as células T por 3 ou 9 dias(Figura 1A,B). Também analisamos seu perfil de diferenciação, como indicado pela estratégia de gating delineada na Figura1C,medindo a abundância de glicoproteínas distintas expressas na superfície celular. Mostramos uma mudança progressiva para a diferenciação efetíbula ao longo do tempo durante a cultura ex vivo (Figura .......
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Discussão
Aqui descrevemos abordagens para medir a função e eficácia das células T CAR colhidas em intervalos variados ao longo da cultura ex vivo. Nossos métodos fornecem uma visão abrangente sobre ensaios projetados para avaliar a capacidade proliferativa, bem como a função efetiva in vitro. Descrevemos como medir a atividade das células T car após a estimulação através do CAR e detalhar os modelos de xenoenxerto de leucemia usando células T CAR colhidas no dia 3 vs dia 9 de sua fase de expansão logarítica.
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte através do financiamento fornecido pela Novartis Pharmaceuticals através de uma aliança de pesquisa com a Universidade da Pensilvânia (Michael C. Milone), bem como st. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti dynabeads CD3/CD28 | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD | Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen | C36950 | ||
| FITC anti-humano CD197 (CCR7) Anticorpo | BD Pharmingen | 561271 | RRID: AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID: AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Soro AB humano | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, grau premium | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamina | Gibco | 28030-081 | |
| Contador de cintilação líquida, MicroBeta trilux | Sondas Moleculares Violetas Fixáveis Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD | L34964 | ||
| Contador de relha Multisizer | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Anticorpo anti-CD14 humano azul | BioLegend | 325616 | RRID: AB_830689 |
| Anticorpo anti-CD19 humano azul do Pacífico | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-humano CD45RO Anticorpo | BD Biosciences | 555493 | RRID: AB_395884 |
| PE / Cy5 anti-humano CD95 (Fas) Anticorpo | BioLegend | 305610 | RRID: AB_493652 |
| PE / Cy7 anti-humano CD27 | Anticorpo Beckman Coulter | A54823 | |
| Meio sem vermelho de fenol | Gibco | 10373-017 | |
| Solução SDS UltraPure, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferina - Sal K+ | Perkin Elmer | 122799 |
Referências
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).
- Grupp, S. A., et al.
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Reimpressões e permissões
