Bruken av thiolated uracil til følsomt og renser spesielt RNA fra gjær Saccharomyces cerevisiae.
Nukleotid analoge, 4-thiouracil (4tU), er lett tatt opp av celler og innlemmet i RNA som det er skrevet i vivo, slik at isolering av RNA produsert i en kort periode med merking. Dette gjøres ved å feste en biotin moiety til innarbeidet alkyltiokarbamid gruppe og affinitet rensing, ved hjelp av streptavidin belagt perler. Å oppnå en god avkastning på ren, nylig syntetisert RNA som er fri for eksisterende RNA, gjør kortere merking ganger mulig og tillater økt Temporal oppløsning i kinetisk studier. Dette er en protokoll for svært spesifikke, høykapasitets rensing av nylig syntetisert RNA. Protokollen som presenteres her beskriver hvordan RNA er Hentet fra gjær Saccharomyces cerevisiae. Protokollen for rensing av thiolated RNA fra total RNA bør imidlertid være effektiv ved hjelp av RNA fra en hvilken som helst organisme når den er Hentet fra cellene. Renset RNA er egnet for analyse av mange brukte teknikker, slik som Reverse transkriptase-qPCR, RNA-SEQ og SLAM-SEQ. Spesifisitet, følsomhet og fleksibilitet av denne teknikken gir uovertruffen innsikt i RNA metabolisme.
RNA har en dynamisk natur; snart etter at den er produsert mye RNA er raskt behandlet og degradert. Foreløpig de fleste studier av RNA metabolisme analysere den totale cellulære RNA, som er mest fullstendig behandlet og på steady state nivå. Dette nivået avhenger av balansen mellom utbredelsen av transkripsjon, post-transcriptional modning og degradering. Analyse av prosesser som fører til steady state likevekt krever spesialiserte teknikker for å fange svært kortvarig RNA arter.
Metabolsk merking av RNA med nukleotid analoger som 4-thiouracil (4tU) eller 4-thiouridine (4sU) (se Duffy et al.1 for en utmerket vurdering), gir muligheten til å isolere Alkyltiokarbamid begynnende RNAs og deres prosessering mellom produkter. Men publiserte protokoller innebære merking ganger av flere minutter2,3, som er langsom i forhold til frekvensen av produksjonen av mange transkripsjoner. Det tar i rekkefølgen av ett minutt å transkribere gjennomsnittlig gjær genet, så merking gjær RNA for mindre enn ett minutt kan betraktes som svært kort. Den ekstremt raske og spesifikke 4 thiouracil protokollen (ers4tU) maksimerer signal til støyforhold ved å maksimere 4tU innlemmelse og minimere utvinningen av umerkede, eksisterende RNA gjør svært kort merking ganger mulig4.
Den alkyltiokarbamid basen må importeres til cellene raskt og i tilstrekkelig mengde til å merke den nye syntetisert RNA (nsRNA) på en effektiv måte. For å fremme dette, er celler dyrket i uracil medium, og uttrykk for en passende permease bidrar til å øke 4tU eller 4sU opptak (se tabell 1 for en liste over plasmider som bærer egnede permease gener og supplerende figur 1). 4tU’s løselighet i natriumhydroksid unngår behovet for giftige organiske løsemidler som kreves av andre nukleotid analoger. Dessverre har det blitt observert voksende kulturer i lange perioder med alkyltiokarbamid nucleosides ved konsentrasjoner som er større enn 50 μM for å forstyrre ribosomer5. Men konsentrasjonen (10 μM) brukes her, og den ekstremt korte merking ganger, minimere skadelige effekter5 (figur 1a), mens fortsatt gir tilstrekkelig RNA for analyse.
Denne teknikken kan kombineres med rask og spesifikk auxin-mediert forringelse av et mål protein6,7 (figur 2), referert til som “β-EST Aid 4U” protokollen, der β-østradiol regulert uttrykk for auxin induserbart degron (AID)-systemet kombineres med 4tU-merking. Med β-EST AID 4U-tilnærmingen kan et mål protein tømmes og effekten på RNA-metabolismen overvåkes nøye (figur 2). Timingen er kritisk; Det er tilrådelig å vise den med følgende videoen og følge nøye med på figur 2 og dens animerte form (se supplerende figur 2).
Prosessering og nedbrytning av RNA må stoppes svært raskt for nøyaktig tidsoppløsning. Dette oppnås ved hjelp av metanol ved lav temperatur, som fikser celleinnholdet svært raskt og forringer cellemembranen samtidig bevare nukleinsyre syre innhold8. RNA-ekstraksjon skal være effektiv og ikke skade RNA-en. Mekanisk lyse er effektivt i fravær av chaotropic midler (ofte disse inneholder alkyltiokarbamid grupper, så bør unngås). Lithium klorid utfelling av RNA foretrekkes, da tRNAs er mindre effektivt igangsatte. tRNAs er raskt kopieres og naturlig thiolated9, så fjerner tRNAs reduserer konkurranse for biotinylation reagens. Hvis små, svært strukturerte RNAs er av interesse, anbefales alkohol-baserte RNA nedbør metoder.
For å gjenopprette thiolated RNA, er biotin covalently festet via de alkyltiokarbamid gruppene innlemmet i RNA med 4tU. Bruk av modifisert biotin, som festes via et spaltbare disulfide (f.eks. HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)pRopionamide,) eller MTS-biotin (metan thiosulfonate)) anbefales som det tillater utgivelsen av RNA ved tilsetning av et reduksjonsmiddel. Biotinylated RNA er affinitet renset på streptavidin koplet til magnetiske perler. Denne protokollen er lik andre som er oppført tidligere10 , men har vært intensivt optimalisert for å redusere bakgrunnen.
Det finnes to typer tiolderivat-eksperiment som kan utføres, kontinuerlig og usammenhengende merking. Hver har sine egne fordeler. I kontinuerlig merking legges 4tU til kulturen og prøvene som tas med jevne mellomrom. Denne typen eksperiment viser hvordan RNA-en behandles, og hvordan nivåene endres over tid. Eksempler er sammenligning av mutant med vill-type eksperimenter og et puls-jage eksperiment. Eksperimentene som vises i figur 3B, c er av denne typen. For usammenhengende merking en endring er indusert inn i systemet og RNA overvåkes. Når endringen har blitt indusert kulturen må deles inn i flere sub-kulturer, og til bestemte tider, hver og en er så alkyltiokarbamid-merket for en kort periode. Et eksempel er β-EST AID 4U vist i figur 27. Denne typen eksperiment er spesielt nyttig for å overvåke effekten av en metabolsk endring på RNA-behandling (se figur 3D).
En grafisk fremstilling av et alkyltiokarbamid-eksperiment er presentert i Figur 4 og figur 5, og et regneark som i stor grad forenkler ytelsen til protokollen er tilgjengelig (se 4tU eksperiment mal. xlsx). I tillegg til dette inneholder utfyllende informasjon en omfattende feilsøkingsveiledning. For β-EST AID 4U-protokollen som integrerer 4tU-merkingen med auxin-protokollen, se figur 2 og supplerende figur 2. Se Barrass et al.7 for den detaljerte nød tømming protokollen.
Denne artikkelen presenterer en protokoll for ekstremt rask og spesifikk 4tU merking, for gjenvinning av begynnende, nylig syntetisert RNA fra S. cerevisiae etter så lite som 15 S for merking, med svært lav forurensning av umerkede RNA.
Brukeren bør alltid sørge for å opprettholde integriteten til RNA-en ved bruk av kalde temperaturer og DEPC-behandlede reagenser. Streptavidin perle rensing er generelt pålitelig; perle bufferen er imidlertid vanskelig å håndtere; Det må gjøres fersk, med sine komponenter lagt i riktig rekkefølge, og ikke kjølt eller autoklaveres. Vanlige svakheter omfatter RNA-ufullstendig som oppløses etter nedbørs trinnene, og det blir heller ikke biotinylated eller på annen måte tapt under behandlingstrinnene. Det er omfattende hjelp til feilsøking i Tilleggsmaterialet.
Det er noen begrensninger å være klar over i ers4tU. En allerede nevnt er at 4tU bremser veksten av gjær (figur 1a). Bortsett fra endogenously thiolated RNAs9, kan bare RNAs som har blitt skrevet ut i løpet av merkings perioden, renses ved denne metoden. Polymerases stanset på gener gjennom thiolation tiden vil ikke produsere thiolated transkripsjoner som kan renses, selv om transkripsjoner som er delvis merket på grunn av Polymerases inn eller forlate en pausetilstand under thiolation kan gjenopprettes. Stammer som transkribere dårlig, enten på grunn av mutasjon eller vekstforhold, produsere lite nsRNA, selv om teknikkene som brukes her vil likevel forbedre utvinningen av nsRNA i forhold til andre metoder. Lengre tider og økt kultur volumer kan være nødvendig i disse stammene og forhold. Merk at uracil er en god kilde til nitrogen og så denne metoden bør være trialed før de brukes for studier som involverer nitrogen sult.
Den ers4tU protokollen er spesielt nyttig for analyse av kortvarig RNAs, hvorav mange er så raskt degradert at de ikke kan identifiseres uten ødeleggende den fornedrelse maskineri. Eksempler er kryptiske ustabile transkripsjoner (CUTs)4, og korte transkripsjoner produsert av tidlig avslutning eller promoter proksimale pause18 og antisens transkripsjon “oppstrøms” fra en promoter (ber)19. De mellom produkter produsert under prosessering av stabile RNA arter er også forbigående, men kan bli beriket ved hjelp av ers4tU transkripsjon4. Ers4tU-protokollen er derfor eksepsjonell i å tillate svært forbigående RNA-arter å bli analysert og tatt under nær fysiologiske forhold, som er en stor fordel i forhold til andre metoder. Denne teknikken har blitt brukt til å studere transkripsjon og nedstrøms RNA prosessering Kinetics i RNA polymerase mutanter som forlenge raskere eller tregere enn normalt20.
Thiolation er likeledes forenlig med RNA-SEQ og SLAM-SEQ21, tillater alle RNA produsert innen en meget kort tid vindu å bli kjennetegnet inne utsøkt detaljen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Wellcome finansiering til JB [104648]. Arbeid i Wellcome senter for Cell Biology er støttet av Wellcome kjerne finansiering [092076]. Forfatterne erkjenner medlemmer av laboratoriet for deres hjelp: Bella sentimental, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias og shiney George. Forfatterne vil også gjerne takke Patrick Cramer for plasmider YEpEBI31111.
β-mercaptoethanol (βME) | Sigma-Aldrich | M3148 | CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 25668 | CAUTION toxic |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave |
DMF (N,N-dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | 227056 | CAUTION toxic |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 29221 | |
EZ-link HPDP Biotin | Thermo scientific | 21341 | Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend. |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
Glycogen [20 mg/mL] | Sigma-Aldrich | 10901393001 | Store at -20 °C |
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel | Thermo Scientific | 77712 | Optional |
LiCl | Sigma-Aldrich | 793620 | 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly. |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63033 | 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-M | 5 M solution |
Phenol, low pH. | Sigma-Aldrich | P4682 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH. | Sigma-Aldrich | P1944 | Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic |
Pierce Spin Columns | Thermo Scientific | 69702 | Optional |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | 32318-M | Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | CAUTION corrosive |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Sigma-Aldrich | 436143 | CAUTION irritant, do not inhale |
Streptavidin Magnetic beads | NEB | 1420S | Store at 4°C |
SUPERase-In, RNase inhibitor | Life technologies | AM2696 | Store at -20°C |
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike | See section 1.7 of the protocol | ||
4-thiouracil (4tU) | ACROS ORGANICS | 359930010 | Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | 1 M solutions at various pH |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | 5mg/ml, store at -20°C |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C. |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 | |
Zeba Columns 0.5ml | Thermo Scientific | 89882 | Store at 4 °C |
Zirconia beads | Thistle Scientific | 110791052 | |
Equipment and Consumables | |||
Beadbeater | Biospec | 112011EUR | Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established. |
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA. | |||
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible. | |||
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g | |||
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist | |||
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark. | |||
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end | |||
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended | |||
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL | Eppendorf | H179467N | |
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL | Ambion | AM12350 | |
Tubes, centrifuge, 50 mL | Sarstedt | 62.547.004 | Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss |
Tubes, centrifuge, 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 | |
Tubes, 2 mL, screw cap | Greiner | 723361 | |
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids | Brand | 781332 |