जीन संपादन प्रौद्योगिकियों ने शोधकर्ताओं को जेब्राफिश म्यूटेंट उत्पन्न करने में सक्षम बनाया है ताकि वे सापेक्ष आसानी से जीन कार्य की जांच कर सकें । यहां, हम जेब्राफिश में सीटू संकरण संकेतों में समानांतर भ्रूण जीनोनोटीपिंग और क्वांटिफिकेशन करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं। यह निष्पक्ष दृष्टिकोण सीटू संकरण के आधार पर फेनोठेठ विश्लेषणों में अधिक सटीकता प्रदान करता है।
सीटू संकरण (ईश) में एक महत्वपूर्ण तकनीक है जो शोधकर्ताओं को सीटू में एमआरएनए वितरण का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है और दशकों से विकासात्मक जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण तकनीक रही है। परंपरागत रूप से, अधिकांश जीन अभिव्यक्ति अध्ययनई ईश सिग्नल के दृश्य मूल्यांकन पर भरोसा करते थे, एक विधि जो पूर्वाग्रह से ग्रस्त होती है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां नमूना पहचान एक प्राथमिकताओं को जाना जाता है। हमने पहले इस पूर्वाग्रह को दरकिनार करने और ईश संकेतों का अधिक सटीक मात्रा प्रदान करने के लिए एक विधि पर रिपोर्ट की है। यहां, हम इस विधि को लागू करने के लिए ISH-दाग भ्रूण में ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल गाइड पेश करते हैं और सहसंबंधित है कि उनके इसी जीनोटाइप के साथ । विधि विशेष रूप से मिश्रित जीनोटाइप के नमूनों में स्थानिक रूप से प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति संकेतों की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी है और यह पारंपरिक दृश्य स्कोरिंग विधियों के लिए एक निष्पक्ष और सटीक विकल्प प्रदान करता है ।
जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों (जेडएफएन, तालेनऔर हाल ही में, CRISPR/Cas9) की शुरूआत के कारण दुनिया भर की प्रयोगशालाओं की संख्या में भारी वृद्धि हुई है जो विवो में विशिष्ट जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए इन प्रणालियों का उपयोग करते हैं । विशेष रूप से जेब्राफिश आनुवंशिक हेरफेर के लिए उत्तरदायी हैं और हाल के दिनों में1,2में कई म्यूटेंट उत्पन्न हुए हैं । विकासजीवजीवियों के लिए, भ्रूण विकास में जीन म्यूटेशन के फेनोठेठ परिणामों का आकलन करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक सीटू संकरण (ईश) में है। स्पष्ट रूपात्मक दोषों के अभाव में जो अपने जंगली प्रकार या विषमताभाई से होमोज़िगौस म्यूटेंट को अलग करते हैं, विभिन्न जीनोटाइप को सही ढंग से सही ढंग से पहचानने में सक्षम होना आवश्यक है।
शास्त्रीय ISH ब्याज और चयनित मार्कर जीन के जीन के बीच नियामक बातचीत के बारे में निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए संकेत तीव्रता के गुणात्मक विश्लेषण पर निर्भर करता है । हालांकि उपयोगी, इन विश्लेषणों तकनीकी भिन्नता से पीड़ित है और शोधकर्ता अपेक्षाओं से पक्षपातपूर्ण हो सकता है । इस प्रकार, इसी जीनोटाइप के पूर्व ज्ञान के बिना, ईश-दाग भ्रूण इमेजिंग के बाद जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। इसके बाद एक कुशल डीएनए निष्कर्षण और जीनोटाइपिंग की अनुमति दी गई जिससे हमें जीन अभिव्यक्ति 3 के साथ मात्रात्मक रूप से जीनोटाइप सहसंबंधित करनेकामौका मिला । जबकि ईश के बाद भ्रूण के जीनोटिपिंग का उपयोग4,5से पहले किया गया है, ईश पैटर्न की छवि आधारित मात्रा का उपयोग6,7अध्ययनों के अलावा व्यापक रूप से नहीं किया गया है । सबसे लोकप्रिय विकल्प दृश्य स्कोरिंग या ISH-दाग कोशिकाओं8,9,10की गिनती पर भरोसा करतेहैं,दोनों गरीब प्रजनन क्षमता और शोधकर्ता पूर्वाग्रह से ग्रस्त हैं । यह विधि विशेष रूप से अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ जीन में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जो स्थानिक रूप से प्रतिबंधित हैं, जैसे कि रनक्स1 या गैटा2बी,दोनों ने हीमोजेनिक एंडोथेलियम11,12नामक महाधमनी मंजिल कोशिकाओं के प्रतिबंधित सबसेट में व्यक्त किया।
यहां, हमारा उद्देश्य फिजी13का उपयोग करके छवि विश्लेषण द्वारा क्वांटिफिकेशन के कार्यान्वयन के साथ-साथ डीएनए निष्कर्षण और जीनोनोटिंग प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के लिए एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका प्रदान करना है। यह नेत्रहीन हमारे पहले प्रकाशित विधि3वर्णन करने के लिए होती है । हमारी विधि ईश द्वारा पता लगाए गए जीन अभिव्यक्ति में भिन्नता और विशिष्ट जीनोटाइप के लिए जीन अभिव्यक्ति के स्तर के निष्पक्ष असाइनमेंट का सटीक प्रतिनिधित्व करने की अनुमति देती है।
जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस विधि का उपयोग करते समय कुछ कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। इमेजिंग स्थितियों को मापन के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए पूरे प्रयोग (उदाहरण के लिए रोशनी, एक्सपोजर समय और भ्रूण स्थिति) में बनाए रखा जाना चाहिए। एक महत्वपूर्ण बिंदु नमूनों के अधिक दाग से बचने के लिए है, के रूप में नमूनों के बीच धुंधला में मतभेद नकाबपोश हो सकता है । उदाहरण के लिए, Xenopus laevis भ्रूण30 में Eto2 की अनुपस्थिति में VegfA अभिव्यक्ति में कमी केवल ध्यान से एक 24 घंटे की अवधि में धुंधला निगरानी द्वारा पता लगाया जा सकता है । इस प्रकार, प्रत्येक जीन के लिए अनुभवजन्य रूप से पर्याप्त धुंधला स्तर निर्धारित करना अच्छा अभ्यास है जो संतृप्ति तक पहुंचने के बिना अपनी अभिव्यक्ति का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता है। ओवरस्नेटिंग भी कृत्रिम रूप से परिवर्तित 8-बिट ग्रेस्केल छवियों में पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता में वृद्धि होगी और क्वांटेशन परिणामों को तिरछा कर देगा। चरम मामलों में, भ्रूण ऊतकों में पृष्ठभूमि का स्तर चयनित आरओआई में ईश सिग्नल से अधिक हो सकता है और इन नमूनों को विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। ऐसी ही एक घटना देखी गई जब हमने पृष्ठभूमि सुधार(चित्रा 4)के लिए अनदाग जर्दी की उपयुक्तता का परीक्षण किया। उलटा और रूपांतरण के बाद 8-बिट जर्दी क्षेत्र में गहरे रंग के पिक्सल भ्रूण में ISH संकेत से उज्जवल हो जाते हैं और पृष्ठभूमि को नकारात्मक मूल्यों को सही करते हैं। इस प्रकार, पृष्ठभूमि सुधार के लिए जर्दी के उपयोग से बचें। भ्रूण में वर्णित क्षेत्रों में पृष्ठभूमि संकेत को मापने (जैसे, आंखें या 26/28 एचपीएफ के बाद से ट्रंक का पृष्ठीय हिस्सा) समान रूप से मात्राकरण परिणामों को तिरछा कर देगा और इससे भी बचा जाना चाहिए। वहां जेब्राफिश भ्रूण ब्लीचिंग के लिए उपलब्ध प्रोटोकॉल हैं, या तो पहले या ISH18 के बाद और विरंजन इमेजिंग से पहले 24 hpf से पुराने भ्रूण ब्लीचिंग की सिफारिश की है ।
क्योंकि यह विधि एक समकक्ष गैर-दाग क्षेत्र में पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता के खिलाफ एक परिभाषित क्षेत्र में पिक्सेल तीव्रता को मापने पर निर्भर करती है, यह सर्वव्यापी या निकट-सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किए गए जीन की मात्रा के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके बजाय, यह अच्छी तरह से एक स्थानिक प्रतिबंधित वितरण के साथ जीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए अनुकूल है, जहां पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता को मापने के लिए एक क्षेत्र आसानी से पहचाना जा सकता है । हमारे अतिरिक्त विश्लेषण से अब पता चलता है कि पृष्ठभूमि सुधार के लिए एक छोटे क्षेत्र (3-4x छोटे) का उपयोग करआरओआई के समकक्ष क्षेत्र का उपयोग करने के समान परिणाम देता है। यह व्यापक स्थानिक डोमेन में व्यक्त जीन के लिए विधि की प्रयोज्यता का विस्तार करता है (और इस प्रकार तीव्रता माप के लिए बड़े ROIs की आवश्यकता होती है), जब तक कोई पृष्ठभूमि सुधार के लिए भ्रूण के स्पष्ट रूप से अनदाग क्षेत्रों का उपयोग कर सकता है।
अंत में, हमारा सुझाव है कि प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करने के लिए समानांतर या छवि परिमाण के बाद जीनोटिपिंग किया जाए। एक दूसरे प्रयोगकर्ता से अनाम नमूनों पर मात्रा दोहराने और माप के पहले सेट के साथ तुलना करने के लिए पूछना भी प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करने में मदद करेगा । यदि मात्रा निर्धारित की जाने वाली छवियां उन उपचारों के बीच तुलना से हैं जिन्हें जेनोटाइपिंग (जैसे, जंगली प्रकार बनाम रासायनिक अवरोधक या जंगली प्रकार बनाम एमओ नॉकडाउन) की आवश्यकता नहीं होती है, तो माप न करने वाले प्रयोगकर्ता को पहचान के लिए अंधा किया जाना चाहिए नमूना.
The authors have nothing to disclose.
हम ऑक्सफोर्ड और बर्मिंघम में बायोमेडिकल सर्विसेज में कर्मचारियों को उत्कृष्ट जेब्राफिश पालन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । टी.डी. एक वेलकम ट्रस्ट क्रोमोसोम और विकासात्मक जीव विज्ञान पीएचडी छात्रवृत्ति (#WT102345/जेड/13/जेड) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । आरएम और एमके को ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन (बीएचएफ IBSR फैलोशिप एफएस/13/50/30436) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और वे अपने उदार समर्थन के लिए आभारी हैं । आर.एम. बीएचएफ सेंटर ऑफ रिसर्च एक्सीलेंस (आरई/13/1/30181), ऑक्सफोर्ड से समर्थन स्वीकार करते हैं ।
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
Excel | Microsoft | ||
F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
Fiji | |||
Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
Thermocycler | Thermofisher |